Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico
Summary
Vari agenti patogeni batterici possono causare infezioni del tratto respiratorio e portare a gravi problemi di salute se non rilevati con precisione e trattati tempestivamente. Il rilevamento rapido e accurato di questi patogeni tramite amplificazione isoterma mediata da loop fornisce una gestione e un controllo efficaci delle infezioni del tratto respiratorio in ambito clinico.
Abstract
Le infezioni delle vie respiratorie (RTI) sono tra i problemi più comuni in ambito clinico. L’identificazione rapida e accurata dei patogeni batterici fornirà linee guida pratiche per la gestione e il trattamento delle RTI. Questo studio descrive un metodo per rilevare rapidamente i patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio tramite amplificazione isotermica mediata da loop multicanale (LAMP). LAMP è uno strumento diagnostico sensibile e specifico che rileva rapidamente gli acidi nucleici batterici con elevata precisione e affidabilità. Il metodo proposto offre un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di coltura batterica, che richiedono molto tempo e spesso una maggiore sensibilità per rilevare bassi livelli di acidi nucleici batterici. Questo articolo presenta risultati rappresentativi dell’infezione da K. pneumoniae e delle sue molteplici co-infezioni utilizzando LAMP per rilevare campioni (espettorato, liquido di lavaggio bronchiale e liquido di lavaggio alveolare) dal tratto respiratorio inferiore. In sintesi, il metodo LAMP multicanale fornisce un mezzo rapido ed efficiente per identificare patogeni batterici singoli e multipli in campioni clinici, che possono aiutare a prevenire la diffusione di patogeni batterici e aiutare nel trattamento appropriato degli RTI.
Introduction
Le infezioni del tratto respiratorio (RTI) causate da agenti patogeni batterici contribuiscono principalmente alla morbilità e alla mortalità in tutto il mondo1. È definito come qualsiasi sintomo delle vie respiratorie superiori o inferiori accompagnato da febbre della durata di 2-3 giorni. Sebbene l’infezione delle vie respiratorie superiori sia più comune di quella delle vie respiratorie inferiori, anche le infezioni croniche e ricorrenti del tratto respiratorio sono condizioni cliniche comuni, che pongono grandi rischi agli individui e gravano in modo significativo sui sistemi sanitari2. I patogeni batterici comuni degli RTI includono Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, tra gli altri. Questi batteri patogeni di solito colonizzano le superfici mucose del rinofaringe e del tratto respiratorio superiore dell’ospite, causando sintomi tipici delle RTI come mal di gola e bronchite. Causano polmonite quando si diffondono dal tratto respiratorio superiore alle aree sterili del tratto respiratorio inferiore e possono diffondersi da persona a persona attraverso il tratto respiratorio5. Nei casi più gravi, possono anche portare a malattie batteriche invasive, in particolare polmonite batteriemica, meningite e sepsi, che sono le principali cause di morbilità e mortalità in persone di tutte le età in tutto il mondo.
I test tradizionali per le RTI prevedono la coltura microbiologica utilizzando tamponi faringei e campioni respiratori di espettorato6. Inoltre, i test sierologici come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) rilevano anticorpi o antigeni nel siero, mentre i test di agglutinazione osservano la reazione di agglutinazione di anticorpi e antigeni per rilevare l’infezione7. La coltura microbica è considerata il gold standard per la diagnosi di RTI, ma il suo basso tasso di positività della coltura, la scarsa affidabilità e il lungo ciclo di rilevamento limitano l’efficienza diagnostica8. In realtà, una diagnosi rapida e accurata degli RTI è fondamentale per l’eradicazione precisa del patogeno batterico. Metodi di rilevamento rapidi ed efficaci possono aiutare a ridurre il tasso di trasmissione degli agenti patogeni, abbreviare la durata dell’infezione e diminuire l’uso non necessario di antibiotici 9,10. I metodi basati sulla biologia molecolare accelerano significativamente il rilevamento, come la reazione a catena della polimerasi (PCR), che amplifica la sequenza di DNA di un gene bersaglio per rilevare gli agenti patogeni. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede apparecchiature complesse per il ciclo della temperatura, che sono ingombranti e richiedono molto tempo. Inoltre, ogni amplificazione del DNA mediante PCR (ad eccezione della PCR in tempo reale) si conclude con la separazione elettroforetica del prodotto, che richiede anch’essa tempo. La visualizzazione del prodotto richiede coloranti, molti dei quali sono mutageni o cancerogeni. Pertanto, è imperativo sviluppare continuamente nuovi metodi e tecnologie per la diagnosi dei patogeni batterici RTI.
L’amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è una tecnologia molecolare innovativa ed emergente inizialmente sviluppata da Notomi et al. nel 200011. LAMP è in grado di amplificare il DNA in condizioni isotermiche stabili senza complesse apparecchiature per il ciclo della temperatura, il che lo rende adatto per un rilevamento rapido e riduce la complessità e i costi delle apparecchiature12. LAMP è in grado di rilevare basse concentrazioni di DNA bersaglio con un’elevata sensibilità13. Utilizza più primer specifici per migliorare la selettività per le sequenze target e ridurre la possibilità di falsi positivi14. LAMP sta gradualmente diventando ampiamente utilizzato nei laboratori clinici grazie alla sua facilità, velocità e funzionamento intuitivo, anche per il rilevamento di RTI. In questo studio, abbiamo studiato l’efficacia della LAMP nel rilevare gli RTI più bassi in campioni clinici (espettorato, liquido di lavaggio bronchiale e liquido di lavaggio alveolare), come mostrato nella Figura 1. È evidente che LAMP offre vantaggi come velocità, sensibilità e facilità d’uso rispetto ai test tradizionali con rilevamento RTI inferiore, rendendolo un’applicazione promettente.
Figura 1: Illustrazione schematica del metodo di rilevamento LAMP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le infezioni delle vie respiratorie sono infezioni ospedaliere prevalenti, che impongono gravi conseguenze ai pazienti e aumentano i tassi di mortalità16. L’identificazione tempestiva e accurata dei potenziali agenti patogeni, seguita da antibiotici efficaci, è la chiave per il successo del trattamento e per migliorare la prognosi, in particolare date le limitazioni insite nei metodi di coltura tradizionali17. In questo studio, abbiamo utilizzato un metodo basato su LAMP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Abbiamo molto apprezzato il sostegno finanziario fornito dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (sovvenzione n. 2022A1515220023) e dalla Research Foundation for Advanced Talents of Guandong Provincial People’s Hospital (sovvenzione n. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
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