Détection rapide d’agents pathogènes bactériens à l’origine d’infections des voies respiratoires inférieures grâce à une amplification isotherme médiée par boucle à base de puce microfluidique
Summary
Divers agents pathogènes bactériens peuvent provoquer des infections des voies respiratoires et entraîner de graves problèmes de santé s’ils ne sont pas détectés avec précision et traités rapidement. La détection rapide et précise de ces agents pathogènes par amplification isotherme médiée par boucle permet une gestion et un contrôle efficaces des infections des voies respiratoires en milieu clinique.
Abstract
Les infections des voies respiratoires (IVR) sont parmi les problèmes les plus courants en milieu clinique. L’identification rapide et précise des agents pathogènes bactériens fournira des lignes directrices pratiques pour la gestion et le traitement des infections des voies respiratoires. Cette étude décrit une méthode permettant de détecter rapidement les agents pathogènes bactériens qui causent des infections des voies respiratoires par amplification isotherme médiée par boucle multicanal (LAMP). LAMP est un outil de diagnostic sensible et spécifique qui détecte rapidement les acides nucléiques bactériens avec une précision et une fiabilité élevées. La méthode proposée offre un avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles de culture bactérienne, qui prennent du temps et nécessitent souvent une plus grande sensibilité pour détecter de faibles niveaux d’acides nucléiques bactériens. Cet article présente des résultats représentatifs de l’infection à K. pneumoniae et de ses multiples co-infections à l’aide de la LAMP pour détecter des échantillons (expectorations, liquide de lavage bronchique et liquide de lavage alvéolaire) des voies respiratoires inférieures. En résumé, la méthode LAMP multicanaux fournit un moyen rapide et efficace d’identifier un ou plusieurs agents pathogènes bactériens dans les échantillons cliniques, ce qui peut aider à prévenir la propagation des agents pathogènes bactériens et à faciliter le traitement approprié des infections des voies respiratoires.
Introduction
Les infections des voies respiratoires (IVR) causées par des agents pathogènes bactériens contribuent principalement à la morbidité et à la mortalité dans le monde1. Il est défini comme tout symptôme des voies respiratoires supérieures ou inférieures accompagné d’une fièvre d’une durée de 2 à 3 jours. Bien que les infections des voies respiratoires supérieures soient plus fréquentes que les infections des voies respiratoires inférieures, les infections chroniques et récurrentes des voies respiratoires sont également des affections cliniques courantes, posant de grands risques pour les individus et imposant un fardeau important aux systèmes de santé2. Les agents pathogènes bactériens courants des infections des voies respiratoires comprennent Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, entre autres. Ces bactéries pathogènes colonisent généralement les surfaces muqueuses du nasopharynx et des voies respiratoires supérieures de l’hôte, provoquant des symptômes typiques des infections des voies respiratoires telles que les maux de gorge et la bronchite. Ils provoquent une pneumonie lorsqu’ils se propagent des voies respiratoires supérieures aux zones stériles des voies respiratoires inférieures et peuvent se propager d’une personne à l’autre par les voies respiratoires5. Dans les cas graves, ils peuvent également entraîner des maladies bactériennes invasives, en particulier la pneumonie bactériémique, la méningite et la septicémie, qui sont les principales causes de morbidité et de mortalité chez les personnes de tous les groupes d’âge dans le monde.
Les tests traditionnels pour les infections respiratoires impliquent une culture microbiologique à l’aide d’écouvillons de gorge et d’échantillons respiratoires d’expectorations6. De plus, les tests sérologiques tels que le test immuno-enzymatique (ELISA) détectent des anticorps ou des antigènes dans le sérum, tandis que les tests d’agglutination observent la réaction d’agglutination des anticorps et des antigènes pour détecter l’infection7. La culture microbienne est considérée comme l’étalon-or pour diagnostiquer les infections des voies respiratoires, mais son faible taux de positivité des cultures, sa faible fiabilité et son long cycle de détection limitent l’efficacité du diagnostic8. En réalité, un diagnostic rapide et précis des infections respiratoires est crucial pour l’éradication précise de l’agent pathogène bactérien. Des méthodes de détection rapides et efficaces peuvent aider à réduire le taux de transmission des agents pathogènes, à raccourcir la durée de l’infection et à diminuer l’utilisation inutile d’antibiotiques 9,10. Les méthodes basées sur la biologie moléculaire accélèrent considérablement la détection, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui amplifie la séquence d’ADN d’un gène cible pour détecter les agents pathogènes. Cependant, la PCR traditionnelle nécessite un équipement complexe de cyclage de température, ce qui est lourd et chronophage. De plus, chaque amplification d’ADN par PCR (à l’exception de la PCR en temps réel) se termine par une séparation électrophorétique du produit, ce qui prend également du temps. La visualisation du produit nécessite des colorants, dont beaucoup sont mutagènes ou cancérigènes. Par conséquent, il est impératif de développer en permanence de nouvelles méthodes et technologies pour diagnostiquer les agents pathogènes bactériens RTI.
L’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) est une technologie moléculaire nouvelle et émergente initialement développée par Notomi et al. en 200011. LAMP peut amplifier l’ADN dans des conditions isothermes stables sans équipement de cyclage de température complexe, ce qui le rend adapté à une détection rapide et réduit la complexité et le coût de l’équipement12. LAMP peut détecter de faibles concentrations d’ADN cible avec une sensibilité élevée13. Il utilise plusieurs amorces spécifiques pour améliorer la sélectivité des séquences cibles et réduire la possibilité de faux positifs14. LAMP est progressivement largement utilisé dans les laboratoires cliniques en raison de sa facilité, de sa rapidité et de son fonctionnement intuitif, même pour la détection des RTI. Dans cette étude, nous avons examiné l’efficacité de la LAMP dans la détection des IVR plus faibles dans les échantillons cliniques (expectorations, liquide de lavage bronchique et liquide de lavage alvéolaire), comme le montre la figure 1. Il est évident que LAMP offre des avantages tels que la vitesse, la sensibilité et la facilité d’utilisation par rapport aux tests traditionnels en matière de détection à faible RTI, ce qui en fait une application prometteuse.
Figure 1 : Illustration schématique de la méthode de détection LAMP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les infections des voies respiratoires sont des infections nosocomiales répandues, qui ont de graves conséquences sur les patients et font grimper les taux de mortalité16. L’identification rapide et précise des agents pathogènes potentiels, suivie d’antibiotiques efficaces, est la clé du succès du traitement et de l’amélioration du pronostic, en particulier compte tenu des limites inhérentes aux méthodes de culture traditionnelles17. Dans cette étude, nous …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous avons grandement apprécié le soutien financier fourni par la Fondation pour la recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (subvention n° 2022A1515220023) et la Fondation de recherche pour les talents avancés de l’hôpital populaire de la province du Guandong (subvention n°. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
- Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150 (2022).
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
- Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
- Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216 (2010).
- Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37 (2019).
- Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA’s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
- Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068 (2022).
- T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63 (2000).
- Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931 (2021).
- Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
- Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57 (2015).
- Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
- Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572 (2012).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
- Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39 (2018).
- Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
- Liang Wang, J. -. X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689 (2023).
- Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622 (2023).
- Wei Liu, J. -. W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921 (2022).
- Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161 (2023).
- Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
- Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612 (2023).
