Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie
Summary
Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.
Abstract
Luchtweginfecties (RTI’s) behoren tot de meest voorkomende problemen in klinische omgevingen. Snelle en nauwkeurige identificatie van bacteriële pathogenen zal praktische richtlijnen opleveren voor het beheer en de behandeling van RTI’s. Deze studie beschrijft een methode voor het snel detecteren van bacteriële pathogenen die luchtweginfecties veroorzaken via meerkanaals lusgemedieerde isotherme amplificatie (LAMP). LAMP is een gevoelig en specifiek diagnostisch hulpmiddel dat snel bacteriële nucleïnezuren detecteert met hoge nauwkeurigheid en betrouwbaarheid. De voorgestelde methode biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele bacteriële kweekmethoden, die tijdrovend zijn en vaak een grotere gevoeligheid vereisen voor het detecteren van lage niveaus van bacteriële nucleïnezuren. Dit artikel presenteert representatieve resultaten van K. pneumoniae-infectie en zijn meerdere co-infecties met behulp van LAMP om monsters (sputum, bronchiale lavagevloeistof en alveolaire lavagevloeistof) uit de onderste luchtwegen te detecteren. Samenvattend biedt de meerkanaals LAMP-methode een snelle en efficiënte manier om enkelvoudige en meervoudige bacteriële pathogenen in klinische monsters te identificeren, wat kan helpen de verspreiding van bacteriële pathogenen te voorkomen en kan helpen bij de juiste behandeling van RTI’s.
Introduction
Luchtweginfecties (RTI’s) veroorzaakt door bacteriële pathogenen dragen voornamelijk bij aan morbiditeit en mortaliteitwereldwijd1. Het wordt gedefinieerd als alle symptomen van de bovenste of onderste luchtwegen die gepaard gaan met koorts die 2-3 dagen aanhoudt. Hoewel infectie van de bovenste luchtwegen vaker voorkomt dan infectie van de onderste luchtwegen, zijn chronische en terugkerende luchtweginfecties ook veel voorkomende klinische aandoeningen, die grote risico’s met zich meebrengen voor individuen en een aanzienlijke belasting vormen voor de gezondheidszorgstelsels2. Veel voorkomende bacteriële pathogenen van RTI’s zijn onder andere Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia. Deze pathogene bacteriën koloniseren meestal de slijmvliesoppervlakken van de neus-keelholte en de bovenste luchtwegen van de gastheer en veroorzaken typische symptomen van RTI’s zoals keelpijn en bronchitis. Ze veroorzaken longontsteking wanneer ze zich verspreiden van de bovenste luchtwegen naar steriele delen van de onderste luchtwegen en kunnen zich van persoon tot persoon verspreiden via de luchtwegen5. In ernstige gevallen kunnen ze ook leiden tot invasieve bacteriële ziekten, met name bacteriëmische longontsteking, meningitis en sepsis, die de belangrijkste oorzaken zijn van morbiditeit en mortaliteit bij mensen van alle leeftijdsgroepen wereldwijd.
Traditionele tests voor RTI’s omvatten microbiologische kweek met behulp van keeluitstrijkjes en sputumademhalingsmonsters6. Bovendien detecteren serologische tests zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) antilichamen of antigenen in serum, terwijl agglutinatietests de agglutinatiereactie van antilichamen en antigenen observeren om infectie te detecteren7. Microbiële cultuur wordt beschouwd als de gouden standaard voor het diagnosticeren van RTI’s, maar het lage cultuurpositiviteitspercentage, de slechte betrouwbaarheid en de lange detectiecyclus beperken de diagnostische efficiëntie8. In werkelijkheid is een snelle en nauwkeurige diagnose van RTI’s cruciaal voor een nauwkeurige uitroeiing van de bacteriële ziekteverwekker. Snelle en effectieve detectiemethoden kunnen helpen de overdrachtssnelheid van ziekteverwekkers te verminderen, de duur van de infectie te verkorten en onnodig antibioticagebruik te verminderen 9,10. Op moleculairbiologie gebaseerde methoden versnellen de detectie aanzienlijk, zoals polymerasekettingreactie (PCR), die de DNA-sequentie van een doelgen versterkt om ziekteverwekkers te detecteren. Traditionele PCR vereist echter complexe apparatuur voor temperatuurwisselingen, wat omslachtig en tijdrovend is. Bovendien wordt elke DNA-amplificatie met behulp van PCR (behalve real-time PCR) afgesloten met elektroforetische scheiding van het product, wat ook tijd kost. Visualisatie van het product vereist kleurstoffen, waarvan er vele mutageen of kankerverwekkend zijn. Daarom is het absoluut noodzakelijk om voortdurend nieuwe methoden en technologieën te ontwikkelen voor het diagnosticeren van RTI-bacteriële pathogenen.
Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) is een nieuwe en opkomende moleculaire technologie die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Notomi et al. in 200011. LAMP kan DNA amplificeren onder stabiele isotherme omstandigheden zonder complexe apparatuur voor temperatuurwisselingen, waardoor het geschikt is voor snelle detectie en de complexiteit en kosten van apparatuur vermindert12. LAMP kan lage concentraties doel-DNA detecteren met een hoge gevoeligheid13. Het maakt gebruik van meerdere specifieke primers om de selectiviteit voor doelsequenties te verbeteren en de kans op valse positieven te verminderen14. LAMP wordt geleidelijk op grote schaal gebruikt in klinische laboratoria vanwege het gemak, de snelheid en de intuïtieve bediening, zelfs voor het detecteren van RTI’s. In deze studie onderzochten we de effectiviteit van LAMP bij het detecteren van lagere RTI’s in klinische monsters (sputum, bronchiale lavagevloeistof en alveolaire lavagevloeistof), zoals weergegeven in figuur 1. Het is duidelijk dat LAMP voordelen biedt zoals snelheid, gevoeligheid en gebruiksgemak ten opzichte van traditionele tests bij detectie van lagere RTI’s, waardoor het een veelbelovende toepassing is.
Figuur 1: Schematische weergave van de LAMP-detectiemethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Luchtweginfecties zijn veel voorkomende ziekenhuisinfecties, die ernstige gevolgen hebben voor patiënten en escalerende sterftecijfers16. Het tijdig en nauwkeurig identificeren van potentiële ziekteverwekkers, gevolgd door effectieve antibiotica, is de sleutel tot een succesvolle behandeling en het verbeteren van de prognose, vooral gezien de beperkingen die inherent zijn aan traditionele kweekmethoden17. In deze studie gebruikten we een op LAMP gebaseerde methode om enke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We hebben de financiële steun van de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (subsidienr. 2022A1515220023) en de Research Foundation for Advanced Talents van het Guandong Provincial People’s Hospital (subsidienr. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
- Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150 (2022).
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
- Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
- Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216 (2010).
- Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37 (2019).
- Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA’s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
- Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068 (2022).
- T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63 (2000).
- Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931 (2021).
- Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
- Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57 (2015).
- Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
- Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572 (2012).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
- Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39 (2018).
- Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
- Liang Wang, J. -. X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689 (2023).
- Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622 (2023).
- Wei Liu, J. -. W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921 (2022).
- Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161 (2023).
- Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
- Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612 (2023).
