Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation
Summary
Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.
Abstract
Atemwegsinfektionen (RTIs) gehören zu den häufigsten Problemen im klinischen Umfeld. Die schnelle und genaue Identifizierung bakterieller Krankheitserreger wird praktische Leitlinien für das Management und die Behandlung von RTI liefern. Diese Studie beschreibt eine Methode zum schnellen Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Atemwegsinfektionen verursachen, mittels Mehrkanalschleifen-vermittelter isothermer Amplifikation (LAMP). LAMP ist ein empfindliches und spezifisches Diagnosewerkzeug, das bakterielle Nukleinsäuren schnell und mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit nachweist. Die vorgeschlagene Methode bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen bakteriellen Kultivierungsmethoden, die zeitaufwändig sind und oft eine höhere Empfindlichkeit für den Nachweis niedriger Mengen an bakteriellen Nukleinsäuren erfordern. In diesem Artikel werden repräsentative Ergebnisse der K . pneumoniae-Infektion und ihrer multiplen Koinfektionen mit LAMP zum Nachweis von Proben (Sputum, Bronchialspülflüssigkeit und Alveolarspülflüssigkeit) aus den unteren Atemwegen vorgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mehrkanal-LAMP-Methode ein schnelles und effizientes Mittel zur Identifizierung einzelner und mehrerer bakterieller Krankheitserreger in klinischen Proben bietet, was dazu beitragen kann, die Ausbreitung bakterieller Krankheitserreger zu verhindern und die angemessene Behandlung von RTIs zu unterstützen.
Introduction
Atemwegsinfektionen (RTIs), die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, tragen weltweit in erster Linie zur Morbidität und Mortalität bei1. Es ist definiert als alle Symptome der oberen oder unteren Atemwege, die von 2-3 Tagen anhaltendem Fieber begleitet werden. Während Infektionen der oberen Atemwege häufiger sind als Infektionen der unteren Atemwege, sind chronische und wiederkehrende Atemwegsinfektionen auch häufige klinische Erkrankungen, die große Risiken für den Einzelnen darstellen und eine erhebliche Belastung für die Gesundheitssysteme darstellen2. Zu den häufigen bakteriellen Erregern von RTIs gehören unter anderem Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia. Diese pathogenen Bakterien besiedeln in der Regel die Schleimhautoberflächen des Nasopharynx und der oberen Atemwege des Wirts und verursachen typische Symptome von RTIs wie Halsschmerzen und Bronchitis. Sie verursachen eine Lungenentzündung, wenn sie sich von den oberen Atemwegen auf sterile Bereiche der unteren Atemwege ausbreiten und sich über die Atemwege von Mensch zu Mensch ausbreitenkönnen 5. In schweren Fällen können sie auch zu invasiven bakteriellen Erkrankungen führen, insbesondere zu bakteriämischer Lungenentzündung, Meningitis und Sepsis, die weltweit die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Menschen aller Altersgruppen sind.
Herkömmliche Tests auf RTI umfassen mikrobiologische Kulturen unter Verwendung von Rachenabstrichen und Sputumproben der Atemwege6. Darüber hinaus weisen serologische Tests wie der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Antikörper oder Antigene im Serum nach, während Agglutinationstests die Agglutinationsreaktion von Antikörpern und Antigenen zum Nachweis einer Infektion beobachten7. Mikrobielle Kulturen gelten als Goldstandard für die Diagnose von RTIs, aber ihre niedrige Positivitätsrate, ihre geringe Zuverlässigkeit und ihr langer Nachweiszyklus schränken die diagnostische Effizienz ein8. In Wirklichkeit ist eine schnelle und genaue Diagnose von RTIs entscheidend für die präzise Ausrottung des bakteriellen Erregers. Schnelle und effektive Nachweismethoden können dazu beitragen, die Übertragungsrate von Krankheitserregern zu verringern, die Infektionsdauer zu verkürzen und den unnötigen Einsatz von Antibiotika zu verringern 9,10. Molekularbiologisch basierte Methoden beschleunigen den Nachweis erheblich, wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der die DNA-Sequenz eines Zielgens zum Nachweis von Krankheitserregern amplifiziert wird. Die traditionelle PCR erfordert jedoch komplexe Temperaturzyklusgeräte, die umständlich und zeitaufwändig sind. Darüber hinaus endet jede DNA-Amplifikation mittels PCR (mit Ausnahme der Real-Time-PCR) mit der elektrophoretischen Trennung des Produkts, was ebenfalls Zeit in Anspruch nimmt. Für die Visualisierung des Produkts werden Farbstoffe benötigt, von denen viele mutagen oder krebserregend sind. Daher ist es zwingend erforderlich, kontinuierlich neue Methoden und Technologien für die Diagnose von bakteriellen RTI-Erregern zu entwickeln.
Die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist eine neuartige und aufstrebende molekulare Technologie, die ursprünglich von Notomi et al. im Jahr 200011 entwickelt wurde. LAMP kann DNA unter stabilen isothermen Bedingungen ohne komplexe Temperaturwechselgeräte amplifizieren, was es für einen schnellen Nachweis geeignet macht und die Komplexität und Kosten der Ausrüstung reduziert12. LAMP kann niedrige Konzentrationen der Ziel-DNA mit hoher Empfindlichkeit nachweisen13. Es werden mehrere spezifische Primer verwendet, um die Selektivität für Zielsequenzen zu verbessern und die Möglichkeit falsch positiver Ergebnisse zu verringern14. LAMP wird aufgrund seiner Leichtigkeit, Geschwindigkeit und intuitiven Bedienung, auch bei der Erkennung von RTIs, nach und nach in klinischen Labors weit verbreitet. In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von LAMP bei der Detektion niedrigerer RTIs in klinischen Proben (Sputum, Bronchialspülflüssigkeit und Alveolarspülflüssigkeit), wie in Abbildung 1 gezeigt. Es ist offensichtlich, dass LAMP Vorteile wie Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit gegenüber herkömmlichen Tests bei der Erkennung von niedrigerem RTI bietet, was es zu einer vielversprechenden Anwendung macht.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der LAMP-Detektionsmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atemwegsinfektionen sind weit verbreitete Krankenhausinfektionen, die schwerwiegende Folgen für die Patienten haben und die Sterblichkeitsraten in die Höhe treiben16. Die rechtzeitige und genaue Identifizierung potenzieller Krankheitserreger, gefolgt von wirksamen Antibiotika, ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Behandlung und einer Verbesserung der Prognose, insbesondere angesichts der Einschränkungen traditioneller Kulturmethoden17. In dieser Studie haben wir ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir haben die finanzielle Unterstützung durch die Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant No. 2022A1515220023) und die Research Foundation for Advanced Talents des Guandong Provincial People’s Hospital (Grant No. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
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