الكشف السريع عن مسببات الأمراض البكتيرية التي تسبب التهابات الجهاز التنفسي السفلي عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة القائمة على رقائق الموائع الدقيقة
Summary
يمكن أن تسبب مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة التهابات الجهاز التنفسي وتؤدي إلى مشاكل صحية خطيرة إذا لم يتم اكتشافها بدقة وعلاجها على الفور. يوفر الكشف السريع والدقيق عن هذه العوامل الممرضة عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة إدارة فعالة ومكافحة التهابات الجهاز التنفسي في البيئات السريرية.
Abstract
تعد التهابات الجهاز التنفسي (RTIs) من بين أكثر المشكلات شيوعا في البيئات السريرية. سيوفر التحديد السريع والدقيق لمسببات الأمراض البكتيرية إرشادات عملية لإدارة وعلاج RTIs. تصف هذه الدراسة طريقة للكشف السريع عن مسببات الأمراض البكتيرية التي تسبب التهابات الجهاز التنفسي عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة متعددة القنوات (LAMP). LAMP هي أداة تشخيصية حساسة ومحددة تكتشف بسرعة الأحماض النووية البكتيرية بدقة وموثوقية عالية. توفر الطريقة المقترحة ميزة كبيرة على طرق زراعة البكتيريا التقليدية ، والتي تستغرق وقتا طويلا وغالبا ما تتطلب حساسية أكبر للكشف عن المستويات المنخفضة من الأحماض النووية البكتيرية. تقدم هذه المقالة نتائج تمثيلية لعدوى K. pneumoniae والعدوى المشتركة المتعددة باستخدام LAMP للكشف عن العينات (البلغم ، سائل غسل الشعب الهوائية ، وسائل غسل السنخية) من الجهاز التنفسي السفلي. باختصار ، توفر طريقة LAMP متعددة القنوات وسيلة سريعة وفعالة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية المفردة والمتعددة في العينات السريرية ، والتي يمكن أن تساعد في منع انتشار مسببات الأمراض البكتيرية والمساعدة في العلاج المناسب ل RTIs.
Introduction
تساهم التهابات الجهاز التنفسي (RTIs) التي تسببها مسببات الأمراض البكتيرية في المقام الأول في المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم1. يتم تعريفه على أنه أي أعراض تنفسية علوية أو سفلية مصحوبة بحمى تستمر 2-3 أيام. في حين أن عدوى الجهاز التنفسي العلوي أكثر شيوعا من عدوى الجهاز التنفسي السفلي ، فإن التهابات الجهاز التنفسي المزمنة والمتكررة هي أيضا حالات سريرية شائعة ، مما يشكل مخاطر كبيرة على الأفراد ويضع عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية2. تشمل مسببات الأمراض البكتيرية الشائعة ل RTIs العقدية الرئوية3 ، المستدمية النزلية4 ، المكورات العنقودية الذهبية ، الإشريكية القولونية ، الكلبسيلة الرئوية ، Stenotrophomonas maltophilia ، من بين أمور أخرى. عادة ما تستعمر هذه البكتيريا المسببة للأمراض الأسطح المخاطية للبلعوم الأنفي للمضيف والجهاز التنفسي العلوي ، مما يسبب أعراضا نموذجية ل RTIs مثل التهاب الحلق والتهاب الشعب الهوائية. تسبب الالتهاب الرئوي عندما تنتشر من الجهاز التنفسي العلوي إلى مناطق معقمة في الجهاز التنفسي السفلي وقد تنتشر من شخص لآخر عبر الجهاز التنفسي5. في الحالات الشديدة ، يمكن أن تؤدي أيضا إلى أمراض بكتيرية غازية ، وخاصة الالتهاب الرئوي الجرثومي والتهاب السحايا والإنتان ، والتي تعد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات لدى الأشخاص من جميع الفئات العمرية في جميع أنحاء العالم.
تتضمن الاختبارات التقليدية ل RTIs الثقافة الميكروبيولوجية باستخدام مسحات الحلق وعينات الجهاز التنفسي للبلغم6. بالإضافة إلى ذلك ، تكتشف الاختبارات المصلية مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) الأجسام المضادة أو المستضدات في المصل ، بينما تراقب اختبارات التراص تفاعل التراص للأجسام المضادة والمستضدات للكشف عن العدوى7. تعتبر الثقافة الميكروبية المعيار الذهبي لتشخيص RTIs ، لكن معدل إيجابية الثقافة المنخفض ، والموثوقية الضعيفة ، ودورة الكشف الطويلة تحد من كفاءة التشخيص8. في الواقع ، يعد التشخيص السريع والدقيق ل RTIs أمرا بالغ الأهمية للقضاء الدقيق على مسببات الأمراض البكتيرية. يمكن أن تساعد طرق الكشف السريعة والفعالة في تقليل معدل انتقال مسببات الأمراض ، وتقصير مدة العدوى ، وتقليل الاستخدام غير الضروري للمضادات الحيوية 9,10. تعمل الطرق القائمة على البيولوجيا الجزيئية على تسريع عملية الكشف بشكل كبير ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي يضخم تسلسل الحمض النووي للجين المستهدف للكشف عن مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي يتطلب معدات معقدة لتدوير درجات الحرارة ، وهو أمر مرهق ويستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، فإن كل تضخيم للحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (باستثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي) يختتم بفصل كهربائي للمنتج ، الأمر الذي يستغرق وقتا أيضا. يتطلب تصور المنتج أصباغ ، كثير منها مطفرة أو مسرطنة. لذلك ، من الضروري التطوير المستمر لطرق وتقنيات جديدة لتشخيص مسببات الأمراض البكتيرية RTI.
التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هي تقنية جزيئية جديدة وناشئة تم تطويرها في البداية بواسطة Notomi et al. في عام 200011. يمكن ل LAMP تضخيم الحمض النووي في ظل ظروف متساوية الحرارة مستقرة بدون معدات دورة درجة حرارة معقدة ، مما يجعله مناسبا للكشف السريع ويقلل من تعقيد المعدات وتكلفتها12. يمكن ل LAMP اكتشاف تركيزات منخفضة من الحمض النووي المستهدف بحساسية عالية13. يستخدم العديد من البادئات المحددة لتحسين الانتقائية للتسلسلات المستهدفة وتقليل احتمالية الإيجابيات الخاطئة14. يتم استخدام LAMP تدريجيا على نطاق واسع في المختبرات السريرية نظرا لسهولة وسرعة تشغيله البديهي ، حتى للكشف عن RTIs. في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في فعالية LAMP في الكشف عن انخفاض RTIs في العينات السريرية (البلغم ، سائل غسل الشعب الهوائية ، وسائل غسل السنخية) ، كما هو موضح في الشكل 1. من الواضح أن LAMP يوفر مزايا مثل السرعة والحساسية وسهولة الاستخدام مقارنة بالاختبارات التقليدية في اكتشاف RTI المنخفض ، مما يجعله تطبيقا واعدا.
الشكل 1: رسم تخطيطي لطريقة الكشف عن LAMP. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنتشر التهابات الجهاز التنفسي في المستشفيات ، مما يفرض عواقب وخيمة على المرضى ويتصاعد معدلات الوفيات16. إن تحديد مسببات الأمراض المحتملة في الوقت المناسب وبدقة تليها المضادات الحيوية الفعالة هو مفتاح العلاج الناجح وتحسين التشخيص ، لا سيما بالنظر إلى القيود المتأصلة في طرق ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر تقديرا كبيرا الدعم المالي المقدم من مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (المنحة رقم 2022A1515220023) ومؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في مستشفى مقاطعة غواندونغ الشعبي (المنحة رقم. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
- Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150 (2022).
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
- Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
- Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216 (2010).
- Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37 (2019).
- Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA’s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
- Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068 (2022).
- T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63 (2000).
- Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931 (2021).
- Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
- Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57 (2015).
- Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
- Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572 (2012).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
- Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39 (2018).
- Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
- Liang Wang, J. -. X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689 (2023).
- Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622 (2023).
- Wei Liu, J. -. W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921 (2022).
- Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161 (2023).
- Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
- Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612 (2023).
