TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu
Summary
Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Abstract
Telomerler, kromozomal uçlarda bulunan tekrarlayan dizilerdir; Kısalmaları, insan somatik hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir. Kısalma, son replikasyon ile ilgili bir sorun ve telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu olan telomeraz enziminin yokluğu nedeniyle oluşur. İlginç bir şekilde, telomerler, kirleticiler, enfeksiyöz ajanlar, besinler veya radyasyon gibi hücre dışı ajanlar nedeniyle etkilenebilecek oksidatif stres ve inflamasyon gibi çeşitli iç fizyolojik süreçlere yanıt olarak da kısalır. Bu nedenle, telomer uzunluğu yaşlanmanın ve çeşitli fizyolojik sağlık parametrelerinin mükemmel bir biyobelirteci olarak hizmet eder. TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti, telomer kısıtlama fragmanı (TRF) testini kullanarak ortalama telomer uzunluklarını ölçmek için kullanılır ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bununla birlikte, pahalı bir yöntemdir ve bu nedenle, büyük örneklem sayıları için rutin olarak kullanılmaz. Burada, Güney lekeleri veya TRF analizi ve radyoaktif olmayan kemilüminesans bazlı algılama kullanılarak telomer uzunluğunun optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Telomerler, kromozomların sonunda bulunan tekrarlayan DNA dizileridir. TTAGGG’nin tandem tekrarlarına sahiptirler ve kromozomu hem yıpranmadan hem de son replikasyon probleminden koruyarak genom bütünlüğünü korurlar, bu da 3′ çıkıntısının bir kısmının DNA polimeraz 1,2 tarafından kopyalanamayacağı anlamına gelir. Kısa telomerler, hücrelerde kromozomal anormalliklere yol açar, çünkü hücreler replikatif yaşlanma3 adı verilen bir aşamada kalıcı olarak tutuklanır. Kısa telomerler ayrıca mitokondri disfonksiyonu 4,5 ve hücre disfonksiyonu gibi bir dizi başka soruna da neden olur.
DNA telomerik tekrarları, hücre bölündüğünde ve bölündüğünde kaybolur, yılda ortalama 25 ila 200 bp kaybı6 ile sonuçlanır, bu da belirli sayıda bölünmeden sonra hücresel yaşlanma ile sonuçlanır6. Yaşlanma, telomer uzunluğu7’de kısalma ile işaretlenen daha yüksek bir komorbidite sıklığı ile ilişkilidir. Telomer kısıtlama fragmanı (TRF) analizi, Mender tarafından tanımlandığı gibi, çok pahalı bir yöntemdir8. Bu nedenle, çoğu çalışmada telomer uzunluğunu ölçerken uygulanmaz.
Günümüzde epidemiyolojik çalışmaların çoğunda telomer uzunluğunun kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) bazlı ölçümleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, qPCR tabanlı yöntem, telomerler ve tek kopyalı gen amplifikasyon ürünleri arasındaki oranı ölçtüğü ve mutlak telomer uzunluğunu ölçmediği için göreceli bir ölçüm yöntemidir. TRF protokolünü kullanarak telomer uzunluğu ölçümü altın standart yöntemdir, çünkü numunedeki telomer uzunluk dağılımını ölçebilir ve ölçümler kilobaz (kb) cinsinden mutlak değerlerle ifade edilebilir. Bununla birlikte, kullanımı sınırlıdır çünkü hantal, emek yoğun ve maliyetlidir. Burada, kemilüminesans bazlı TRF’leri kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
TRF analizi yedi ana adımı içerir: 1) genomik DNA ekstraksiyonu için hücrelerin kültürlenmesi, 2) fenol: kloroform: izoamilalkol (P: C: I) yöntemi kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, 3) genomik DNA’nın kısıtlama sindirimi, 4) agaroz jeli elektroforezi, 5) kısıtlama sindirim DNA fragmanının güney lekelenmesi, 6) hibridizasyon ve tespit yoluyla Kemilüminesans-İmmobilize telomer probu, alkali fosfataz, disodyum 2-kloro-5-(4-metoksispiro[1,2-dioksetan-3,2′-(5-klorotrisiklo [3.3.1.13.7]dekan])-4-yl]-1-fenil fosfat (CDP-Star)-ve 7) analizi için oldukça hassas bir kemilüminesan substrat ile görselleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Güney lekelemesi kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için radyoaktif olmayan, kemilüminesans bazlı bir yöntem için ayrıntılı bir prosedür tarif ediyoruz. Protokol, sonuçların kalitesinden ödün vermeden birkaç reaktifin akıllıca kullanılmasına izin verecek şekilde test edilmiştir. Prehibridizasyon ve hibridizasyon tamponu beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. Enzim konsantrasyonu, sonuçları etkilemeden 1.5-2 μg genomik DNA başına 10-20 U arasında değişebilir. DIG etiketli moleküler a?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Prachi Shah’a başlangıçta protokol optimizasyonunda bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Dr. Manoj Garg’a A2780 yumurtalık kanseri hücre hattını sağladığı için teşekkür ederiz. EK, Biyoteknoloji Bölümü’nden (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Bilim ve Teknoloji Bölümü (ECR/2018/002117) ve NMIMS Tohum Hibesi (IO 401405) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
