Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG
Summary
Aquí, describimos en detalle el protocolo para cuantificar la longitud de los telómeros utilizando la detección quimioluminiscente no radiactiva, con un enfoque en la optimización de varios parámetros de rendimiento del kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG, como cantidades de tampón y concentraciones de sonda.
Abstract
Los telómeros son secuencias repetitivas que están presentes en los extremos cromosómicos; Su acortamiento es un rasgo característico de las células somáticas humanas. El acortamiento se produce debido a un problema con la replicación final y la ausencia de la enzima telomerasa, que es responsable de mantener la longitud de los telómeros. Curiosamente, los telómeros también se acortan en respuesta a diversos procesos fisiológicos internos, como el estrés oxidativo y la inflamación, que pueden verse afectados debido a agentes extracelulares como contaminantes, agentes infecciosos, nutrientes o radiación. Por lo tanto, la longitud de los telómeros sirve como un excelente biomarcador del envejecimiento y varios parámetros fisiológicos de salud. El kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG se utiliza para cuantificar longitudes promedio de telómeros utilizando el ensayo de fragmento de restricción de telómeros (TRF) y es altamente reproducible. Sin embargo, es un método costoso, y debido a esto, no se emplea rutinariamente para grandes números de muestra. Aquí, describimos un protocolo detallado para una medición optimizada y rentable de la longitud de los telómeros utilizando Southern blots o análisis TRF y detección basada en quimioluminiscencia no radiactiva.
Introduction
Los telómeros son las secuencias repetitivas de ADN presentes al final de los cromosomas. Tienen repeticiones en tándem de TTAGGG y mantienen la integridad del genoma protegiendo el cromosoma tanto del deshilachado como del problema de replicación final, lo que significa que parte del voladizo 3′ no puede ser replicado por la ADN polimerasa 1,2. Los telómeros cortos conducen a anomalías cromosómicas en las células, debido a lo cual las células se detienen permanentemente en una etapa llamada senescencia replicativa3. Los telómeros cortos también causan una serie de otros problemas, como la disfunción mitocondrial 4,5 y la disfunción celular.
Las repeticiones teloméricas de ADN se pierden a medida que la célula se divide, con una pérdida promedio de 25 a 200 pb por año 6, lo que resulta en senescencia celular después de un cierto número de divisiones6. El envejecimiento se asocia con una mayor frecuencia de comorbilidades, que se caracteriza por un acortamiento en la longitud de los telómeros7. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF), descrito por Mender, es un método muy costoso8. Debido a esto, no se implementa al cuantificar la longitud de los telómeros en la mayoría de los estudios.
Actualmente, la mayoría de los estudios epidemiológicos emplean mediciones cuantitativas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de la longitud de los telómeros. Sin embargo, el método basado en qPCR es un método de medición relativa, ya que mide la relación entre los telómeros y los productos de amplificación génica de copia única, y no la longitud absoluta de los telómeros. La medición de la longitud de los telómeros utilizando el protocolo TRF es el método estándar de oro, ya que puede medir la distribución de la longitud de los telómeros en la muestra y las mediciones se pueden expresar en valores absolutos en kilobases (kb). Sin embargo, su uso es limitado porque es engorroso, requiere mucha mano de obra y es costoso. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para la medición de la longitud de los telómeros utilizando TRF basados en quimioluminiscencia.
El análisis TRF incluye siete pasos principales: 1) cultivo de células para la extracción de ADN genómico, 2) extracción de ADN genómico utilizando el método fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (P: C: I), 3) digestión de restricción de ADN genómico, 4) electroforesis en gel de agarosa, 5) transferencia sur del fragmento de ADN de digestión de restricción, 6) hibridación y detección a través de quimioluminiscencia: la sonda de telómeros inmovilizados se visualiza mediante un sustrato quimioluminiscente altamente sensible para fosfatasa alcalina, análisis disódico de 2-cloro-5-(4-metoxiespiro[1,2-dioxetano-3,2′-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decan])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-y 7) para obtener información media sobre la longitud y el rango de los telómeros de estos frotis teloméricos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un procedimiento detallado para un método no radiactivo basado en la quimioluminiscencia para la medición de la longitud de los telómeros mediante Southern blotting. El protocolo ha sido probado para permitir el uso juicioso de varios reactivos sin comprometer la calidad de los resultados. El tampón de prehibridación e hibridación se puede reutilizar hasta cinco veces. La concentración de enzimas puede variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de ADN genómico sin afectar los resultados. Varios otros componen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Sra. Prachi Shah por ayudarnos inicialmente con la optimización del protocolo. Nos gustaría agradecer al Dr. Manoj Garg por proporcionar la línea celular de cáncer de ovario A2780. EK cuenta con el apoyo de una subvención de investigación del Departamento de Biotecnología (No. BT / RLF / Reingreso / 06/2015), el Departamento de Ciencia y Tecnología (ECR / 2018 / 002117) y la Subvención Semilla NMIMS (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
