Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG
Summary
Aqui, descrevemos em detalhes o protocolo de quantificação do comprimento dos telômeros usando detecção quimioluminescente não radioativa, com foco na otimização de vários parâmetros de desempenho do kit de ensaio de comprimento de telômeros TAGGG, tais como quantidades de tampão e concentrações de sonda.
Abstract
Telômeros são sequências repetitivas que estão presentes nas extremidades cromossômicas; seu encurtamento é uma característica das células somáticas humanas. O encurtamento ocorre devido a um problema com a replicação final e à ausência da enzima telomerase, responsável pela manutenção do comprimento dos telômeros. Curiosamente, os telômeros também encurtam em resposta a vários processos fisiológicos internos, como estresse oxidativo e inflamação, que podem ser impactados devido a agentes extracelulares como poluentes, agentes infecciosos, nutrientes ou radiação. Assim, o comprimento dos telômeros serve como um excelente biomarcador do envelhecimento e de vários parâmetros fisiológicos de saúde. O kit de ensaio de comprimento de telômero TAGGG é usado para quantificar comprimentos teloméricos médios usando o ensaio de fragmento de restrição de telômeros (TRF) e é altamente reprodutível. No entanto, é um método caro e, por isso, não é empregado rotineiramente para grandes números amostrais. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma medição otimizada e econômica do comprimento dos telômeros usando análise de Southern blots ou TRF e detecção baseada em quimioluminescência não radioativa.
Introduction
Telômeros são as sequências repetitivas de DNA presentes no final dos cromossomos. Eles têm repetições em tandem de TTAGGG e mantêm a integridade do genoma protegendo o cromossomo tanto do desgaste quanto do problema de replicação final, o que significa que parte da saliência 3′ não pode ser replicada pela DNA polimerase 1,2. Telômeros curtos levam a anormalidades cromossômicas nas células, devido às quais as células ficam permanentemente presas em um estágio chamado senescência replicativa3. Os telômeros curtos também causam uma série de outros problemas, como disfunção mitocondrial 4,5 e disfunção celular.
As repetições teloméricas do DNA são perdidas à medida que a célula se divide, com perda média de 25 a 200 pb por ano 6, resultando em senescência celular após certo número de divisões6. O envelhecimento está associado à maior frequência de comorbidades, marcada pelo encurtamento do comprimento dos telômeros7. A análise do fragmento de restrição dos telômeros (TRF), como descrito por Mender, é um método muitodispendioso8. Devido a isso, ela não é implementada durante a quantificação do comprimento dos telômeros na maioria dos estudos.
Atualmente, a maioria dos estudos epidemiológicos emprega medidas quantitativas do comprimento dos telômeros baseadas na reação em cadeia da polimerase (qPCR). No entanto, o método baseado em qPCR é um método de medição relativa, pois mede a razão entre telômeros e produtos de amplificação gênica de cópia única, e não o comprimento absoluto dos telômeros. A medida do comprimento dos telômeros utilizando o protocolo TRF é o método padrão-ouro, pois pode medir a distribuição do comprimento dos telômeros na amostra e as medidas podem ser expressas em valores absolutos em quilobases (kb). No entanto, seu uso é limitado porque é pesado, trabalhoso e caro. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medição do comprimento dos telômeros usando TRFs baseados em quimioluminescência.
A análise do TRF inclui sete etapas principais: 1) cultivo de células para extração de DNA genômico, 2) extração de DNA genômico usando o método fenol:clorofórmio:isoamiloálcool (P:C:I), 3) digestão de restrição do DNA genômico, 4) eletroforese em gel de agarose, 5) Southern blotting do fragmento de DNA de digestão de restrição, 6) hibridização e detecção via quimioluminescência-a sonda telomérica imobilizada é visualizada por um substrato quimioluminescente altamente sensível para fosfatase alcalina, 2-cloro-5-(4-metoxispiro[1,2-dioxetano-3,2′-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decan])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-e 7) para obter informações sobre o comprimento e alcance telomérico médio desses esfregaços teloméricos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um procedimento detalhado para um método não radioativo, baseado em quimioluminescência, para medição do comprimento dos telômeros usando Southern blotting. O protocolo foi testado para permitir o uso criterioso de vários reagentes sem comprometer a qualidade dos resultados. O tampão de pré-hibridização e hibridização pode ser reutilizado até cinco vezes. A concentração da enzima pode variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de DNA genômico sem afetar os resultados. Vários outros componentes do ki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Sra. Prachi Shah por nos ajudar inicialmente com a otimização do protocolo. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Manoj Garg por fornecer a linha de células de câncer de ovário A2780. A EK é apoiada por uma Bolsa de Pesquisa do Departamento de Biotecnologia (nº BT/RLF/Re-entry/06/2015), Departamento de Ciência e Tecnologia (ECR/2018/002117) e NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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