TAGGG端粒长度测定性能参数优化
Summary
在这里，我们详细描述了使用非放射性化学发光检测量化端粒长度的方案，重点是优化TAGGG端粒长度测定试剂盒的各种性能参数，例如缓冲液量和探针浓度。
Abstract
端粒是存在于染色体末端的重复序列;它们的缩短是人类体细胞的特征。缩短是由于末端复制的问题和端粒酶的缺失而发生的，端粒酶负责维持端粒长度。有趣的是，端粒也会响应各种内部生理过程而缩短，如氧化应激和炎症，这些过程可能由于污染物、传染因子、营养物质或辐射等细胞外因素而受到影响。因此，端粒长度是衰老和各种生理健康参数的极好生物标志物。TAGGG 端粒长度测定试剂盒用于使用端粒限制性片段 （TRF） 测定来量化平均端粒长度，并且具有高度可重复性。然而，这是一种昂贵的方法，因此，它不常规用于大样本数量。在这里，我们描述了一个详细的方案，用于使用南方印迹或TRF分析以及基于非放射性化学发光的检测来优化且经济高效地测量端粒长度。
Introduction
端粒是存在于染色体末端的重复DNA序列。它们具有TTAGGG的串联重复，并通过保护染色体免受磨损和末端复制问题来维持基因组完整性，这意味着3’突出的部分无法被DNA聚合酶1，2复制。短端粒导致细胞染色体异常，因此细胞在称为复制衰老3的阶段永久停滞。短端粒还会导致许多其他问题，例如线粒体功能障碍4，5 和细胞功能障碍。
当细胞分裂时，DNA端粒重复序列丢失，平均每年损失25至200 bp6，导致细胞在一定次数的分裂后衰老6。衰老与合并症的频率较高有关，其特征是端粒长度缩短7。正如Mender所描述的端粒限制性片段（TRF）分析是一种非常昂贵的方法8。因此，在大多数研究中，在量化端粒长度时没有实施。
目前，大多数流行病学研究采用基于定量聚合酶链反应（qPCR）的端粒长度测量。然而，基于qPCR的方法是一种相对测量方法，因为它测量端粒和单拷贝基因扩增产物之间的比率，而不是绝对端粒长度。使用 TRF 协议测量端粒长度是金标准方法，因为它可以测量样品中的端粒长度分布，并且测量值可以用以千碱基 （kb） 为单位的绝对值表示。然而，它的使用是有限的，因为它繁琐、劳动密集型且成本高昂。在这里，我们提出了一种使用基于化学发光的TRF测量端粒长度的优化协议。
TRF 分析包括七个主要步骤：1） 培养用于基因组 DNA 提取的细胞，2） 使用苯酚：氯仿：异戊醇 （P：C：I） 方法进行基因组 DNA 提取，3） 基因组 DNA 的限制性酶切，4） 琼脂糖凝胶电泳，5） 限制性酶切 DNA 片段的南部印迹，6） 杂 交和检测化学发光 – 固定化端粒探针通过碱性磷酸酶的高灵敏度化学发光底物可视化，2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-（5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基]-1-苯基磷酸酯（CDP-Star）-和7）分析，以从这些端粒涂片中获得平均端粒长度和范围信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了一种使用南方印迹法测量端粒长度的非放射性、基于化学发光的方法的详细程序。该方案已经过测试，允许明智地使用多种试剂，而不会影响结果质量。预杂交和杂交缓冲液最多可重复使用五次。酶浓度可以在每1.5-2μg基因组DNA的10-20U之间变化，而不会影响结果。其他几种试剂盒组分，如DIG标记的分子量标记物和杂交探针，可以在低于推荐浓度的浓度下使用。优化的卷如 表 2</stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Prachi Shah女士最初帮助我们优化协议。我们要感谢Manoj Garg博士提供A2780卵巢癌细胞系。EK得到了生物技术系（编号BT / RLF / Re-entry/06 / 2015），科学和技术部（ECR / 2018 / 002117）和NMIMS种子基金（IO 401405）的研究资助。
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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