Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays
Summary
Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung verschiedener Leistungsparameter des TAGGG-Telomerlängen-Assay-Kits liegt, wie z.B. Puffermengen und Sondenkonzentrationen.
Abstract
Telomere sind sich wiederholende Sequenzen, die an den Chromosomenenden vorhanden sind. Ihre Verkürzung ist ein charakteristisches Merkmal menschlicher Körperzellen. Die Verkürzung tritt aufgrund eines Problems mit der Endreplikation und des Fehlens des Telomerase-Enzyms auf, das für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge verantwortlich ist. Interessanterweise verkürzen sich Telomere auch als Reaktion auf verschiedene interne physiologische Prozesse wie oxidativen Stress und Entzündungen, die durch extrazelluläre Stoffe wie Schadstoffe, Infektionserreger, Nährstoffe oder Strahlung beeinflusst werden können. Somit dient die Telomerlänge als hervorragender Biomarker für das Altern und verschiedene physiologische Gesundheitsparameter. Das TAGGG Telomerlängen-Assay-Kit wird zur Quantifizierung der durchschnittlichen Telomerlängen mit dem Telomerrestriktionsfragment (TRF)-Assay verwendet und ist hochgradig reproduzierbar. Es handelt sich jedoch um eine teure Methode, die daher nicht routinemäßig für große Stichprobenzahlen eingesetzt wird. In dieser Arbeit beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine optimierte und kostengünstige Messung der Telomerlänge mittels Southern Blots oder TRF-Analyse und nicht-radioaktiver Chemilumineszenz-basierter Detektion.
Introduction
Telomere sind die sich wiederholenden DNA-Sequenzen, die am Ende der Chromosomen vorhanden sind. Sie haben Tandemwiederholungen von TTAGGG und bewahren die Genomintegrität, indem sie das Chromosom sowohl vor dem Ausfransen als auch vor dem Endreplikationsproblem schützen, was bedeutet, dass ein Teil des 3′-Überhangs nicht von der DNA-Polymerase 1,2 repliziert werden kann. Kurze Telomere führen zu Chromosomenanomalien in den Zellen, wodurch die Zellen in einem Stadium, das als replikative Seneszenz bezeichnetwird, dauerhaft blockiert werden 3. Kurze Telomere verursachen auch eine Vielzahl anderer Probleme, wie z. B. die Dysfunktion der Mitochondrien 4,5 und die Dysfunktion der Zellen.
DNA-Telomerwiederholungen gehen verloren, wenn sich die Zelle teilt, mit einem durchschnittlichen Verlust von 25 bis 200 bp pro Jahr 6, was nach einer bestimmten Anzahl von Teilungen zu einer zellulären Seneszenz führt6. Das Altern ist mit einer höheren Häufigkeit von Komorbiditäten verbunden, die durch eine Verkürzung der Telomerlänge gekennzeichnet ist7. Die Analyse von Telomerrestriktionsfragmenten (TRF), wie sie von Mender beschrieben wird, ist eine sehr teure Methode8. Aus diesem Grund wird es in den meisten Studien bei der Quantifizierung der Telomerlänge nicht implementiert.
Gegenwärtig verwenden die meisten epidemiologischen Studien quantitative Messungen der Telomerlänge auf Basis der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Die qPCR-basierte Methode ist jedoch eine relative Messmethode, da sie das Verhältnis zwischen Telomeren und Einzelkopien-Genamplifikationsprodukten und nicht die absolute Telomerlänge misst. Die Telomerlängenmessung mit dem TRF-Protokoll ist die Goldstandardmethode, da sie die Telomerlängenverteilung in der Probe messen kann und die Messungen in absoluten Werten in Kilobasen (kb) ausgedrückt werden können. Seine Verwendung ist jedoch begrenzt, da es umständlich, arbeitsintensiv und kostspielig ist. In dieser Arbeit stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Telomerlängenmessung mit Chemilumineszenz-basierten TRFs vor.
Die TRF-Analyse umfasst sieben Hauptschritte: 1) Kultivierung von Zellen für die genomische DNA-Extraktion, 2) genomische DNA-Extraktion mit der Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (P:C:I)-Methode, 3) Restriktionsverdauung genomischer DNA, 4) Agarose-Gelelektrophorese, 5) Southern-Blotting des Restriktionsverdau-DNA-Fragments, 6) Hybridisierung und Detektion über Chemilumineszenz-Die immobilisierte Telomersonde wird durch ein hochempfindliches chemilumineszentes Substrat für alkalische Phosphatase, Dinatrium-2-Chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2′-(5-chlortricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenylphosphat (CDP-Star)-und 7)-Analyse visualisiert, um Informationen über die mittlere Telomerlänge und -reichweite aus diesen Telomerausstrichen zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein detailliertes Verfahren für eine nicht-radioaktive, Chemilumineszenz-basierte Methode zur Telomerlängenmessung mittels Southern Blotting. Das Protokoll wurde getestet, um die vernünftige Verwendung mehrerer Reagenzien ohne Kompromisse bei der Qualität der Ergebnisse zu ermöglichen. Der Vorhybridisierungs- und Hybridisierungspuffer kann bis zu fünfmal wiederverwendet werden. Die Enzymkonzentration kann zwischen 10 und 20 U pro 1,5 bis 2 μg genomischer DNA variieren, ohne dass die Ergebnisse beei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten uns bei Frau Prachi Shah dafür bedanken, dass sie uns anfangs bei der Optimierung des Protokolls geholfen hat. Wir bedanken uns bei Dr. Manoj Garg für die Bereitstellung der A2780 Eierstockkrebszelllinie. Das EK wird durch ein Forschungsstipendium des Departements für Biotechnologie (Nr. BT/RLF/Re-entry/06/2015), des Departements für Wissenschaft und Technologie (ECR/2018/002117) und des NMIMS Seed Grant (IO 401405) unterstützt.
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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