Здесь мы подробно описываем протокол количественного определения длины теломер с использованием нерадиоактивного хемилюминесцентного детектирования с акцентом на оптимизацию различных параметров производительности набора для анализа длины теломер TAGGG, таких как буферные количества и концентрации зонда.
Теломеры представляют собой повторяющиеся последовательности, которые присутствуют на концах хромосом; Их укорочение является характерной особенностью соматических клеток человека. Укорочение происходит из-за проблемы с репликацией концов и отсутствия фермента теломеразы, который отвечает за поддержание длины теломер. Интересно, что теломеры также укорачиваются в ответ на различные внутренние физиологические процессы, такие как окислительный стресс и воспаление, на которые могут влиять внеклеточные агенты, такие как загрязняющие вещества, инфекционные агенты, питательные вещества или радиация. Таким образом, длина теломер служит отличным биомаркером старения и различных физиологических параметров здоровья. Набор для анализа длины теломер TAGGG используется для количественного определения средней длины теломер с использованием анализа фрагмента рестрикции теломер (TRF) и обладает высокой воспроизводимостью. Однако это дорогостоящий метод, и из-за этого он обычно не используется для больших чисел выборки. Здесь мы описываем подробный протокол для оптимизированного и экономически эффективного измерения длины теломер с использованием Southern Blots или TRF-анализа и нерадиоактивного детектирования на основе хемилюминесценции.
Теломеры – это повторяющиеся последовательности ДНК, присутствующие на концах хромосом. Они имеют тандемные повторы TTAGGG и поддерживают целостность генома, защищая хромосому как от износа, так и от проблемы репликации конца, что означает, что часть 3′-навеса не может быть реплицирована ДНК-полимеразой 1,2. Короткие теломеры приводят к хромосомным аномалиям в клетках, из-за чего клетки постоянно останавливаются на стадии, называемой репликативным старением3. Короткие теломеры также вызывают множество других проблем, таких как дисфункция митохондрий 4,5 и клеточная дисфункция.
Теломерные повторы ДНК теряются по мере деления клетки со средней потерей от 25 до 200.н. в год 6, что приводит к клеточному старению после определенного количества делений6. Старение связано с более высокой частотой сопутствующих заболеваний, которая отмечается укорочением длины теломер7. Анализ фрагментов рестрикции теломер (TRF), описанный Мендером, является очень дорогим методом8. Из-за этого он не применяется при количественном определении длины теломер в большинстве исследований.
В настоящее время в большинстве эпидемиологических исследований используются количественные измерения длины теломер на основе полимеразной цепной реакции (кПЦР). Однако метод на основе кПЦР является относительным методом измерения, поскольку он измеряет соотношение между теломерами и продуктами амплификации генов одной копии, а не абсолютную длину теломер. Измерение длины теломер с использованием протокола TRF является методом золотого стандарта, поскольку он может измерять распределение длины теломер в образце, а измерения могут быть выражены в абсолютных значениях в килобазах (кб). Однако его использование ограничено, поскольку он громоздкий, трудоемкий и дорогостоящий. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для измерения длины теломер с использованием TRF на основе хемилюминесценции.
TRF-анализ включает семь основных этапов: 1) культивирование клеток для выделения геномной ДНК, 2) выделение геномной ДНК с использованием метода фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (P:C:I), 3) рестрикционное переваривание геномной ДНК, 4) электрофорез в агарозном геле, 5) Южное блоттинг фрагмента ДНК рестрикционного расщепления, 6) гибридизация и детектирование с помощью хемилюминесценция – иммобилизованный зонд теломер визуализируется высокочувствительным хемилюминесцентным субстратом для щелочной фосфатазы, динатриевым 2-хлор-5-(4-метоксиспиро[1,2-диоксетан-3,2′-(5-хлортрицикло[3.3.1.13.7]декан])-4-ил]-1-фенилфосфатом (CDP-Star)-и 7) для получения информации о средней длине теломер и дальности из этих теломерных мазков.
Мы подробно описываем процедуру нерадиоактивного, основанного на хемилюминесценции метода измерения длины теломер с использованием блоттинга Саузерна. Протокол был протестирован, чтобы обеспечить разумное использование нескольких реагентов без ущерба для качества результатов. Буф…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить г-жу Прачи Шах за помощь в оптимизации протокола. Мы хотели бы поблагодарить доктора Маноджа Гарга за предоставление клеточной линии рака яичников A2780. EK поддерживается исследовательским грантом Департамента биотехнологии (No BT / RLF / Re-entry / 06/2015), Департамента науки и технологий (ECR / 2018 / 002117) и грантом NMIMS Seed (IO 401405).
Cell Line | |||
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
Equipment | |||
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
Software | |||
TeloTool | Version 1.3 | ||
Materials | |||
Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
Agarose | MP | 180720 | |
Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
Reagents | |||
1 kb ladder | NEB | N3232S | |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |