אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG
Summary
כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.
Abstract
טלומרים הם רצפים חוזרים הנמצאים בקצוות הכרומוזומליים; הקיצור שלהם הוא מאפיין אופייני של תאים סומטיים אנושיים. הקיצור מתרחש עקב בעיה בשכפול הסופי והיעדר אנזים הטלומראז, האחראי על שמירת אורך הטלומרים. באופן מעניין, הטלומרים גם מתקצרים בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים פנימיים שונים, כמו עקה חמצונית ודלקת, שעלולים להיות מושפעים מגורמים חוץ-תאיים כמו מזהמים, חומרים זיהומיים, חומרי מזון או קרינה. לפיכך, אורך הטלומרים משמש סמן ביולוגי מצוין להזדקנות ולפרמטרים בריאותיים פיזיולוגיים שונים. ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG משמשת לכימות אורכי הטלומרים הממוצעים באמצעות בדיקת מקטע הגבלת הטלומרים (TRF) והיא ניתנת לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, זוהי שיטה יקרה, ובגלל זה, זה לא משמש באופן שגרתי עבור מספרים מדגם גדול. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידה אופטימלית וחסכונית של אורך הטלומרים באמצעות כתמים דרומיים או ניתוח TRF וזיהוי מבוסס כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית.
Introduction
טלומרים הם רצפי דנ”א חוזרים הנמצאים בקצה הכרומוזומים. יש להם חזרות דו-צדדיות של TTAGGG והם שומרים על שלמות הגנום על ידי הגנה על הכרומוזום הן מפני שחיקה והן מפני בעיית השכפול הסופית, מה שאומר שחלק מ-3′ overhang אינו ניתן לשכפול על ידי DNA פולימראז 1,2. טלומרים קצרים מובילים להפרעות כרומוזומליות בתאים, שבגללן תאים נעצרים לצמיתות בשלב שנקרא הזדקנות משוכפלת3. טלומרים קצרים גורמים גם לשורה של בעיות אחרות, כגון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 4,5 ותפקוד לקוי של התאים.
חזרות טלומריות של דנ”א אובדות כאשר התא מתחלק, עם אובדן ממוצע של 25 עד 200 bp בשנה 6, וכתוצאה מכך הזדקנות התא לאחר מספר מסוים של חלוקות6. הזדקנות קשורה לתדירות גבוהה יותר של תחלואה נלווית, אשר מסומנת על ידי קיצור אורך הטלומרים7. ניתוח מקטע הגבלת טלומר (TRF), כפי שתואר על ידי מנדר, הוא שיטה יקרה מאוד8. בגלל זה, זה לא מיושם בעת כימות אורך הטלומרים ברוב המחקרים.
כיום, רוב המחקרים האפידמיולוגיים משתמשים במדידות כמותיות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של אורך הטלומרים. עם זאת, השיטה מבוססת qPCR היא שיטת מדידה יחסית, שכן היא מודדת את היחס בין טלומרים לבין תוצרי הגברה של גנים בעותק יחיד, ולא אורך טלומרים מוחלט. מדידת אורך הטלומרים באמצעות פרוטוקול TRF היא שיטת תקן הזהב, מכיוון שהיא יכולה למדוד את התפלגות אורך הטלומרים במדגם וניתן לבטא את המדידות בערכים מוחלטים בקילו-בסיסים (kb). עם זאת, השימוש בו מוגבל מכיוון שהוא מסורבל, עתיר עבודה ויקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי למדידת אורך הטלומרים באמצעות TRF מבוסס כימילומינסנציה.
ניתוח TRF כולל שבעה שלבים עיקריים: 1) תרבית תאים למיצוי DNA גנומי, 2) מיצוי DNA גנומי באמצעות שיטת פנול:כלורופורם:איזואמילאלכוהול (P:C:I), 3) הגבלת עיכול של DNA גנומי, 4) אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז, 5) כתם דרומי של מקטע DNA עיכול הגבלה, 6) הכלאה וגילוי באמצעות כימילומינסנציה – בדיקת הטלומרים המשותקת מומחשת על ידי מצע כימילומינסנטי רגיש ביותר עבור פוספטאז אלקליין, דיסודיום 2-כלורו-5-(4-מתוקסיספירו[1,2-דיוקסטאן-3,2′-(5-כלורוטריציקלו[3.3.1.13.7]דקאן])-4-yl]-1-פניל פוספט (CDP-Star)-ו-7) ניתוח לקבלת אורך וטווח טלומרים ממוצע ומידע טווח ממריחות טלומריות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים הליך מפורט לשיטה לא רדיואקטיבית, מבוססת כימילומינסנציה למדידת אורך הטלומרים באמצעות כתם דרומי. הפרוטוקול נבדק כדי לאפשר שימוש מושכל במספר ריאגנטים ללא פשרות על איכות התוצאות. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפרה-הכלאה וההכלאה עד חמש פעמים. ריכוז האנזימים יכול לנוע בין 10-20 U לכל 1.5-2 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לגב’ פראצ’י שאה על שעזרה לנו בתחילה באופטימיזציה של הפרוטוקול. ברצוננו להודות לד”ר מנוג’ גארג על אספקת קו תאי סרטן השחלות A2780. EK נתמך על ידי מענק מחקר מהמחלקה לביוטכנולוגיה (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), המחלקה למדע וטכנולוגיה (ECR/2018/002117), ומענק זרעים NMIMS (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
