TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化
Summary
ここでは、非放射性化学発光検出を用いてテロメア長を定量するためのプロトコルについて、TAGGGテロメア長アッセイキットの様々な性能パラメータ(緩衝液量やプローブ濃度など)の最適化を中心に詳細に説明する。
Abstract
テロメアは染色体末端に存在する反復配列です。それらの短縮はヒト体細胞の特徴です。短縮は、末端複製の問題およびテロメア長の維持に関与するテロメラーゼ酵素の欠如のために起こる。興味深いことに、テロメアは、汚染物質、感染性病原体、栄養素、放射線などの細胞外因子によって影響を受ける可能性のある酸化ストレスや炎症などのさまざまな内部生理学的プロセスに応答して短くなります。したがって、テロメア長は、老化および様々な生理学的健康パラメータの優れたバイオマーカーとして役立つ。TAGGGテロメア長アッセイキットは、テロメア制限フラグメント(TRF)アッセイを使用して平均テロメア長を定量するために使用され、再現性が高いです。ただし、これは高価な方法であり、このため、サンプル数が多い場合は日常的に採用されていません。ここでは、サザンブロットまたはTRF分析と非放射性化学発光ベースの検出を使用して、テロメア長を最適化して費用対効果の高い測定を行うための詳細なプロトコルについて説明します。
Introduction
テロメアは、染色体の末端に存在する反復DNA配列です。それらはTTAGGGのタンデムリピートを持ち、染色体をほつれと末端複製の問題の両方から保護することによってゲノムの完全性を維持します、それは3’オーバーハングの一部がDNAポリメラーゼ1,2によって複製できないことを意味します。短いテロメアは細胞の染色体異常を引き起こし、そのため細胞は複製老化3と呼ばれる段階で永久に停止します。短いテロメアは、ミトコンドリア機能障害4,5や細胞機能障害など、他の多くの問題も引き起こします。
DNAテロメアの繰り返しは、細胞が分裂すると失われ、年間平均25〜200 bpの損失6、一定数の分裂後に細胞老化が生じます6。老化は併存疾患の頻度が高くなり、テロメアの長さが短くなるのが特徴です7。Menderによって記述されているように、テロメア制限フラグメント(TRF)分析は非常に高価な方法です8。このため、ほとんどの研究ではテロメアの長さを定量化しながらは実施されていません。
現在、疫学研究の大部分は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)ベースの測定を採用しています。ただし、qPCRベースの方法は、テロメアとシングルコピー遺伝子増幅産物の比率を測定するため、相対的な測定方法であり、絶対的なテロメア長ではありません。TRFプロトコルを使用したテロメア長測定は、サンプル中のテロメア長分布を測定でき、測定値はキロベース(kb)単位の絶対値で表すことができるため、ゴールドスタンダードの方法です。ただし、面倒で労働集約的でコストがかかるため、使用は制限されています。ここでは、化学発光ベースのTRFを使用したテロメア長測定に最適化されたプロトコルを紹介します。
TRF解析には、1)ゲノムDNA抽出のための細胞の培養、2)フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(P:C:I)法を用いたゲノムDNA抽出、3)ゲノムDNAの制限酵素処理、4)アガロースゲル電気泳動、5)制限酵素処理DNA断片のサザンブロッティング、6)ハイブリダイゼーションおよび検出 による ハイブリダイゼーション、および検出の7つの主要なステップが含まれます。化学発光-固定化されたテロメアプローブは、アルカリホスファターゼの高感度化学発光基質、2-クロロ-5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2′-(5-クロロトリシクロ[3.3.1.13.7]デカン])-4-イル]-1-フェニルリン酸(CDP-Star)-およびこれらのテロメア塗抹標本から平均テロメアの長さと範囲の情報を得るための7)分析によって視覚化されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
サザンブロッティングを用いたテロメア長測定のための非放射性化学発光ベースの方法の詳細な手順について説明します。このプロトコルは、結果の品質を損なうことなく、いくつかの試薬を賢明に使用できるようにテストされています。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションバッファーは、最大5回まで再利用することができる。酵素濃度は、結果に影響を与えること…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロトコルの最適化を最初に手伝ってくれたPrachi Shahさんに感謝します。A2780卵巣がん細胞株を提供してくださったManoj Garg博士に感謝します。EKは、バイオテクノロジー部門(No. BT/RLF/Re-entry/06/2015)、科学技術部門(ECR/2018/002117)、およびNMIMSシードグラント(IO 401405)からの研究助成金によってサポートされています。
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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