TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화
Summary
여기에서는 완충액 양 및 프로브 농도와 같은 TAGGG 텔로미어 길이 분석 키트의 다양한 성능 매개변수 최적화에 중점을 두고 비방사성 화학발광 검출을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
텔로미어는 염색체 말단에 존재하는 반복적인 서열입니다. 그들의 단축은 인간 체세포의 특징입니다. 단축은 말단 복제 문제와 텔로미어 길이 유지를 담당하는 텔로머라아제 효소의 부재로 인해 발생합니다. 흥미롭게도 텔로미어는 산화 스트레스 및 염증과 같은 다양한 내부 생리학적 과정에 대한 반응으로 짧아지며, 이는 오염 물질, 감염원, 영양소 또는 방사선과 같은 세포 외 물질로 인해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 텔로미어 길이는 노화 및 다양한 생리적 건강 매개변수의 우수한 바이오마커 역할을 합니다. TAGGG 텔로미어 길이 분석 키트는 텔로미어 제한 단편(TRF) 분석을 사용하여 평균 텔로미어 길이를 정량화하는 데 사용되며 재현성이 높습니다. 그러나 비용이 많이 드는 방법이며 이 때문에 많은 수의 샘플에 일상적으로 사용되지 않습니다. 여기에서는 서던 블롯 또는 TRF 분석 및 비방사성 화학발광 기반 검출을 사용하여 텔로미어 길이를 최적화하고 비용 효율적으로 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
텔로미어는 염색체 끝에 존재하는 반복적인 DNA 서열입니다. 그들은 TTAGGG의 탠덤 반복을 가지고 있으며 염색체를 닳아 없어지고 말단 복제 문제로부터 보호함으로써 게놈 무결성을 유지하는데, 이는 3′ 돌출부의 일부가 DNA 중합효소 1,2에 의해 복제될 수 없음을 의미합니다. 짧은 텔로미어는 세포에서 염색체 이상을 일으키며, 이로 인해 세포는 복제 노화3이라는 단계에서 영구적으로 정지됩니다. 짧은 텔로미어는 또한 미토콘드리아 기능 장애 4,5 및 세포 기능 장애와 같은 다른 많은 문제를 일으킵니다.
DNA 텔로미어 반복은 세포가 분열할 때 소실되며, 매년 평균 25-200 bp의 손실이 발생하며6, 일정 수의 분열 후에 세포 노화가 일어난다6. 노화는 더 높은 빈도의 동반 질환과 관련이 있으며, 이는 텔로미어 길이가 짧아지는 것을 특징으로 한다7. 텔로미어 제한 단편(Telomere restriction fragment, TRF) 분석은, 멘더(Mender)에 의해 기술된 바와 같이, 매우 비용이 많이 드는 방법이다8. 이 때문에 대부분의 연구에서 텔로미어 길이를 정량화하는 동안 구현되지 않습니다.
현재 대부분의 역학 연구는 텔로미어 길이의 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 측정을 사용합니다. 그러나 qPCR 기반 방법은 절대 텔로미어 길이가 아닌 텔로미어와 단일 복제 유전자 증폭 산물 간의 비율을 측정하기 때문에 상대적인 측정 방법입니다. TRF 프로토콜을 사용한 텔로미어 길이 측정은 샘플의 텔로미어 길이 분포를 측정할 수 있고 측정값을 킬로베이스(kb) 단위의 절대값으로 표현할 수 있기 때문에 황금 표준 방법입니다. 그러나 번거롭고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 사용이 제한적입니다. 여기에서는 화학발광 기반 TRF를 사용한 텔로미어 길이 측정에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
TRF 분석에는 1) 게놈 DNA 추출을 위한 세포 배양, 2) 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(P:C:I) 방법을 사용한 게놈 DNA 추출, 3) 게놈 DNA의 제한 소화, 4) 아가로스 겔 전기영동, 5) 제한 소화 DNA 단편의 서던 블랏팅, 6) 하이브리드화 및 검출을 통한 7가지 주요 단계가 포함됩니다 화학발광 – 고정된 텔로미어 프로브는 알칼리성 포스파타제에 대한 고감도 화학발광 기질인 디소듐 2-클로로-5-(4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2′-(5-클로로트리사이클로[3.3.1.13.7]데칸])-4-일]-1-페닐 포스페이트(CDP-Star)-및 7) 이러한 텔로미어 도말로부터 평균 텔로미어 길이 및 범위 정보를 얻기 위한 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
서던 블로팅(Southern blotting)을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하기 위한 비방사성 화학발광 기반 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 결과의 품질에 대한 타협 없이 여러 시약을 현명하게 사용할 수 있도록 테스트되었습니다. 프리하이브리드화 및 하이브리드화 버퍼는 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다. 효소 농도는 결과에 영향을 미치지 않고 게놈 DNA 1.5-2 μg 당 10-20 U 사이에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
처음에 프로토콜 최적화를 도와준 Ms. Prachi Shah에게 감사드립니다. A2780 난소암 세포주를 제공한 Manoj Garg 박사에게 감사드립니다. EK는 생명공학부(No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), 과학기술부(ECR/2018/002117) 및 NMIMS Seed Grant(IO 401405)의 연구 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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