تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG
Summary
هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول تحديد طول التيلومير باستخدام الكشف الكيميائي غير المشع ، مع التركيز على تحسين معلمات الأداء المختلفة لمجموعة فحص طول التيلومير TAGGG ، مثل الكميات العازلة وتركيزات المسبار.
Abstract
التيلوميرات هي تسلسلات متكررة موجودة في نهايات الكروموسومات. تقصيرها هو سمة مميزة للخلايا الجسدية البشرية. يحدث التقصير بسبب مشكلة في النسخ المتماثل النهائي وغياب إنزيم التيلوميراز المسؤول عن الحفاظ على طول التيلومير. ومن المثير للاهتمام أن التيلوميرات تقصر أيضا استجابة للعمليات الفسيولوجية الداخلية المختلفة ، مثل الإجهاد التأكسدي والالتهاب ، والتي قد تتأثر بسبب العوامل خارج الخلية مثل الملوثات أو العوامل المعدية أو المغذيات أو الإشعاع. وبالتالي ، فإن طول التيلومير بمثابة علامة حيوية ممتازة للشيخوخة ومعايير الصحة الفسيولوجية المختلفة. تستخدم مجموعة فحص طول التيلومير TAGGG لتحديد متوسط أطوال التيلومير باستخدام مقايسة جزء تقييد التيلومير (TRF) وهي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. ومع ذلك ، فهي طريقة مكلفة ، ولهذا السبب ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني لأعداد العينات الكبيرة. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس محسن وفعال من حيث التكلفة لطول التيلومير باستخدام البقع الجنوبية أو تحليل TRF والكشف القائم على التلألؤ الكيميائي غير المشع.
Introduction
التيلوميرات هي تسلسلات الحمض النووي المتكررة الموجودة في نهاية الكروموسومات. لديهم تكرارات ترادفية ل TTAGGG ويحافظون على سلامة الجينوم من خلال حماية الكروموسوم من كل من الاهتراء ومشكلة النسخ المتماثل النهائي ، مما يعني أن جزءا من الجزء المتدلي 3 بوصات لا يمكن تكراره بواسطة بوليميراز الحمض النووي 1,2. تؤدي التيلوميرات القصيرة إلى تشوهات كروموسومية في الخلايا ، بسبب توقف الخلايا بشكل دائم في مرحلة تسمى الشيخوخة المتماثلة3. تسبب التيلوميرات القصيرة أيضا مجموعة من المشاكل الأخرى ، مثل خلل الميتوكوندريا 4,5 وخلل الخلية.
يتم فقدان التكرارات التيلوميرية للحمض النووي عندما تنقسم الخلية ، بمتوسط خسارة من 25 إلى 200 نقطة أساس في السنة 6 ، مما يؤدي إلى الشيخوخة الخلوية بعد عدد معين من الانقسامات6. ترتبط الشيخوخة بتواتر أعلى من الأمراض المصاحبة ، والتي تتميز بتقصير طولالتيلومير 7. تحليل جزء تقييد التيلومير (TRF) ، كما وصفه ميندر ، هو طريقة مكلفة للغاية8. لهذا السبب ، لا يتم تنفيذه أثناء تحديد طول التيلومير في معظم الدراسات.
في الوقت الحاضر ، تستخدم غالبية الدراسات الوبائية قياسات كمية لطول التيلومير القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على qPCR هي طريقة قياس نسبية ، لأنها تقيس النسبة بين التيلوميرات ومنتجات تضخيم الجينات أحادية النسخة ، وليس طول التيلومير المطلق. قياس طول التيلومير باستخدام بروتوكول TRF هو الطريقة القياسية الذهبية ، حيث يمكنه قياس توزيع طول التيلومير في العينة ويمكن التعبير عن القياسات بالقيم المطلقة بالكيلوباس (kb). ومع ذلك ، فإن استخدامه محدود لأنه مرهق وكثيف العمالة ومكلف. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لقياس طول التيلومير باستخدام TRFs القائمة على التلألؤ الكيميائي.
يتضمن تحليل TRF سبع خطوات رئيسية: 1) زراعة الخلايا لاستخراج الحمض النووي الجينومي ، 2) استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام الفينول: الكلوروفورم: طريقة كحول الأيزو أميل(P: C: I) ، 3) تقييد هضم الحمض النووي الجينومي ، 4) هلام الأغاروز الكهربائي ، 5) النشاف الجنوبي لجزء الحمض النووي لهضم التقييد ، 6) التهجين والكشف عن طريق التلألؤ الكيميائي – يتم تصور مسبار التيلومير المتجمد بواسطة ركيزة كيميائية شديدة الحساسية للفوسفاتيز القلوي ، ثنائي الصوديوم 2-كلورو -5- (4-ميثوكسي سبيرو [1،2-ديوكسيتان-3،2′- (5-كلوروتريسيكلو [3.3.1.13.7] ديكان]) -4-يل] -1-فينيل فوسفات (CDP-Star) – و 7) تحليل للحصول على متوسط طول التيلومير ومعلومات النطاق من هذه اللطاخات التيلومية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا إجراء مفصلا لطريقة غير مشعة قائمة على التلألؤ الكيميائي لقياس طول التيلومير باستخدام النشاف الجنوبي. وقد اختبر البروتوكول للسماح بالاستخدام الحكيم للعديد من الكواشف دون المساس بجودة النتائج. يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت للتهجين والتهجين حتى خمس مرات. يمكن أن يتراوح تركيز الإن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا للسيدة براتشي شاه لمساعدتنا في البداية في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور مانوج جارج على توفير خط خلايا سرطان المبيض A2780. يتم دعم EK من خلال منحة بحثية من قسم التكنولوجيا الحيوية (رقم BT / RLF / Re-entry / 06/2015) ، وقسم العلوم والتكنولوجيا (ECR / 2018 / 002117) ، ومنحة NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
