Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu
Summary
ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5’i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.
Abstract
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.
Introduction
Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir1. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser 2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)5, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların formaldehit destekli izolasyonu)6, MAPit (bireysel şablonlar için metiltransferaz erişilebilirlik protokolü)7 ve bu makalenin odak noktası, ATAC-seq (transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil)8’i içerir. DNase-seq, DNaz’ın temel bir özelliğini, yani histonlardan ve transkripsiyonfaktörleri 5 gibi diğer proteinlerden arındırılmış çıplak DNA’nın tercihli sindirimini kullanarak erişilebilir bölgeleri haritalandırır. ChIP-seq’e benzer şekilde FAIRE-seq, immünopresipitasyon söz konusu olmadığı sürece formaldehit çapraz bağlama ve sonikasyon kullanır ve nükleozomsuz bölgeler fenol-kloroform ekstraksiyonu6 ile izole edilir. MAPit yöntemi, tek moleküllü çözünürlük7’de kromatin yapısını araştırmak için bir GC metiltransferaz kullanır. ATAC-seq, hiperaktif transpozaz, Tn58’e dayanır. Tn5 transpozaz, tercihen açık kromatin bölgelerine bağlanır ve sıralama adaptörlerini erişilebilir bölgelere yerleştirir. Tn5, DNA aracılı bir “kes ve yapıştır” mekanizması ile çalışır, böylece adaptörlerle önceden yüklenmiş transpozaz kromatin bölgelerini açmaya bağlanır, DNA’yı keser ve adaptörleribağlar 8. Tn5’e bağlı bölgeler, bu adaptörleri besleyen primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu ile geri kazanılır. FAIRE-seq ve DNase-seq,9’u sıralamadan önce büyük miktarda başlangıç malzemesi (~ 100.000 hücre ila 225.000 hücre) ve ayrı bir kütüphane hazırlama adımı gerektirir. Öte yandan, ATAC-seq protokolü nispeten basittir ve az sayıda hücre gerektirir (<50.000 hücre)10. FAIRE-seq ve DNase-seq tekniklerinin aksine, ATAC-seq’in dizileme kütüphanesi hazırlığı nispeten kolaydır, çünkü izole DNA örneği zaten Tn5 tarafından dizileme adaptörleri ile etiketlenmiştir. Bu nedenle, kütüphane hazırlığını tamamlamak için sadece uygun primerlere sahip PCR amplifikasyon adımına ihtiyaç vardır ve son onarım ve adaptör ligasyonu gibi önceki işlem adımlarının gerçekleştirilmesine gerek yoktur, böylece zamandan tasarruf edilir11. İkincisi, ATAC-seq, MAPit7 için gerekli olan bölgeye özgü primerlerle bisülfit dönüşümü, klonlama ve amplifikasyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu avantajlardan dolayı, ATAC-seq açık kromatin bölgelerini tanımlamak için oldukça popüler bir yöntem haline gelmiştir. ATAC-seq yöntemi basit olmasına rağmen, yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için birden fazla adım optimizasyon gerektirir. Bu makalede, standart ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı için optimizasyon prosedürleri tartışılmakta ve özellikle üç parametre vurgulanmaktadır: (1) lizis tampon bileşimi, (2) Tn5 transpozaz konsantrasyonu ve (3) hücre sayısı. Ek olarak, bu makale hem kanserli hem de kanserli olmayan yapışkan epitel hücrelerini kullanan optimizasyon koşullarından örnek veriler sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı30 sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UND Genomics Core tesisine olağanüstü teknik yardım için minnettarız.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri [P20GM104360 – M.T., P20 GM104360 – AD] ve Kuzey Dakota Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi, Biyomedikal Bilimler Bölümü [MT’ye] tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
