がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化
Summary
ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。
Abstract
ハイスループットシーケンシング(ATAC-seq)プローブを用いたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイは、高活性Tn5トランスポザーゼを用いたデオキシリボ核酸(DNA)アクセシビリティです。Tn5は、アダプターを切断およびライゲーションして、アクセス可能なクロマチン領域内でのハイスループットシーケンシングを実現します。真核細胞では、ゲノムDNAは、DNA、ヒストン、およびその他のタンパク質の複合体であるクロマチンにパッケージ化されており、転写機構に対する物理的な障壁として機能します。外因性シグナルに応答して、転写因子はクロマチンリモデリング複合体を動員し、遺伝子活性化のための転写機構へのアクセスを可能にします。したがって、オープンクロマチン領域の同定は、癌の進行などの生物学的事象中のエンハンサーおよび遺伝子プロモーター活性をモニタリングする場合に有用である。このプロトコルは使いやすく、細胞投入要件が低いため、ATAC-seqは、がん細胞を含むさまざまな細胞タイプのオープンクロマチン領域を定義するために広く採用されています。データ集録を成功させるには、ATAC-seqライブラリを準備する際にいくつかのパラメータを考慮する必要があります。その中で、細胞溶解バッファーの選択、Tn5酵素の滴定、および細胞の開始量は、癌細胞におけるATAC-seqライブラリ調製にとって非常に重要です。高品質のデータを生成するには、最適化が不可欠です。ここでは、上皮細胞型に対するATAC-seq最適化法について詳細に説明する。
Introduction
クロマチンアクセシビリティは、ゲノムワイドスケールでの遺伝子発現調節の重要な要件です1。クロマチンアクセシビリティの変化は、癌を含むいくつかの病状と頻繁に関連しています2,3,4。長年にわたり、研究者がクロマチンアクセシビリティの領域をマッピングすることによってクロマチンランドスケープを調査できるようにするために、多くの技術が開発されてきました。その中には、DNase-seq(DNase I過敏性部位シーケンシング)5、FAIRE-seq(ホルムアルデヒドによる調節要素の単離)6、MAPit(個々のテンプレートに対するメチルトランスフェラーゼアクセシビリティプロトコル)7、および本論文の焦点であるATAC-seq(トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ)8などがあります。DNase-seqは、DNaseの重要な特徴、すなわちヒストンや転写因子5などの他のタンパク質を含まない裸のDNAを優先的に消化することを利用して、アクセス可能な領域をマッピングします。FAIRE-seqは、ChIP-seqと同様に、免疫沈降が関与しないことを除いて、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理を利用し、ヌクレオソームを含まない領域はフェノール-クロロホルム抽出によって単離されます6。MAPitメソッドは、GCメチルトランスフェラーゼを使用して、単一分子分解能でクロマチン構造をプローブします7。ATAC-seqは、活性亢進トランスポザーゼTn58に依存しています。Tn5トランスポザーゼは、開いたクロマチン領域に優先的に結合し、シーケンシングアダプターをアクセス可能な領域に挿入します。Tn5は、DNAを介した「カットアンドペースト」メカニズムを介して動作し、アダプターをプリロードしたトランスポザーゼが開いたクロマチン部位に結合し、DNAを切断し、アダプターをライゲーションします8。Tn5結合領域は、これらのアダプターにアニールするプライマーを用いたPCR増幅によって回収される。FAIRE-seqおよびDNase-seqは、大量の出発物質(~100,000細胞から225,000細胞)と、シーケンシング9の前に別のライブラリ調製ステップを必要とします。一方、ATAC-seqプロトコルは比較的単純で、必要な細胞数(<50,000セル)10です。FAIRE-seqおよびDNase-seq技術とは異なり、単離されたDNAサンプルはすでにTn5によってシーケンシングアダプターでタグ付けされているため、ATAC-seqのシーケンシングライブラリ調製は比較的簡単です。したがって、ライブラリ調製を完了するために適切なプライマーによるPCR増幅ステップのみが必要であり、エンドリペアおよびアダプターライゲーションなどの事前処理ステップを実行する必要はなく、したがって時間を節約する11。第二に、ATAC-seqは、MAPit7に必要な領域特異的プライマーによるバイサルファイト変換、クローニング、および増幅の必要性を回避します。これらの利点により、ATAC-seqはオープンクロマチン領域を定義するための非常に一般的な方法になりました。ATAC-seq法は単純ですが、高品質で再現性のあるデータを得るためには、複数のステップを最適化する必要があります。この原稿では、標準的なATAC-seqライブラリ調製の最適化手順について説明し、特に(1)溶解バッファー組成、(2)Tn5トランスポザーゼ濃度、および(3)細胞数の3つのパラメーターを強調しています。さらに、この論文では、癌性および非癌性の付着上皮細胞の両方を使用した最適化条件からのサンプルデータを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seqは、オープンクロマチン領域と活性クロマチン領域のマッピングに広く使用されています。がん細胞の進行は、遺伝子の変化やエピジェネティックなリプログラミングによって駆動されることが多く、その結果、クロマチンへのアクセス可能性と遺伝子発現が変化します。このリプログラミングの例は、腫瘍転移中の重要な細胞リプログラミングプロセスであることが知られている上?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
優れた技術支援を提供してくれたUNDゲノミクスコア施設に感謝します。
この研究は、国立衛生研究所[P20GM104360からM.T.、P20 GM104360からA.D.]によって資金提供され、ノースダコタ大学医学部および健康科学部、生物医科学部[M.T.へ]から提供されたスタートアップ資金によって資金提供されました。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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