Оптимизация ATAC-Seq для исследований эпигенетики рака
Summary
ATAC-seq – это метод секвенирования ДНК, который использует гиперактивную мутантную транспозазу Tn5 для отображения изменений доступности хроматина, опосредованных факторами транскрипции. ATAC-seq позволяет обнаружить молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипических изменений в раковых клетках. Этот протокол описывает процедуры оптимизации для ATAC-seq в типах эпителиальных клеток, включая раковые клетки.
Abstract
Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) проверяет доступность дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с использованием гиперактивной транспозазы Tn5. Адаптеры Tn5 для резки и лигата для высокопроизводительного секвенирования в доступных областях хроматина. В эукариотических клетках геномная ДНК упакована в хроматин, комплекс ДНК, гистонов и других белков, который действует как физический барьер для транскрипционного механизма. В ответ на внешние сигналы транскрипционные факторы рекрутируют комплексы ремоделирования хроматина, чтобы обеспечить доступ к транскрипционному механизму активации генов. Поэтому идентификация открытых областей хроматина полезна при мониторинге активности энхансера и генного промотора во время биологических событий, таких как прогрессирование рака. Поскольку этот протокол прост в использовании и имеет низкую потребность во входе клеток, ATAC-seq был широко принят для определения открытых областей хроматина в различных типах клеток, включая раковые клетки. Для успешного сбора данных при подготовке библиотек ATAC-seq необходимо учитывать несколько параметров. Среди них выбор буфера лизиса клеток, титрование фермента Tn5 и начальный объем клеток имеют решающее значение для подготовки библиотеки ATAC-seq в раковых клетках. Оптимизация необходима для получения высококачественных данных. Здесь мы приводим подробное описание методов оптимизации ATAC-seq для типов эпителиальных клеток.
Introduction
Доступность хроматина является ключевым требованием для регуляции экспрессии генов по общегеномной шкале1. Изменения доступности хроматина часто связаны с несколькими болезненными состояниями, включая рак 2,3,4. На протяжении многих лет были разработаны многочисленные методы, позволяющие исследователям исследовать ландшафт хроматина путем картирования областей доступности хроматина. Некоторые из них включают DNase-seq (секвенирование гиперчувствительных сайтов DNase I)5, FAIRE-seq (формальдегидная изоляция регуляторных элементов)6, MAPit (протокол доступности метилтрансферазы для отдельных шаблонов)7 и фокус данной статьи, ATAC-seq (анализ для транспозаз-доступного хроматина)8. DNase-seq отображает доступные области, используя ключевую особенность ДНКазы, а именно предпочтительное переваривание голой ДНК, свободной от гистонов и других белков, таких как факторы транскрипции5. FAIRE-seq, подобно ChIP-seq, использует сшивание формальдегида и обработку ультразвуком, за исключением того, что иммунопреципитация не участвует, а области, свободные от нуклеосом, выделяются экстракцией фенол-хлороформа6. Метод MAPit использует GC метилтрансферазу для исследования структуры хроматина с одномолекулярным разрешением7. ATAC-seq полагается на гиперактивную транспозазу, Tn58. Транспозаза Tn5 предпочтительно связывается с открытыми областями хроматина и вставляет адаптеры секвенирования в доступные области. Tn5 работает через ДНК-опосредованный механизм «вырезать и вставить», в результате чего транспозаза, предварительно загруженная адаптерами, связывается с открытыми участками хроматина, разрезает ДНК и лицензирует адаптеры8. Связанные с Tn5 области восстанавливаются путем амплификации ПЦР с использованием праймеров, которые отжигают эти адаптеры. FAIRE-seq и DNase-seq требуют большого количества исходного материала (~ 100 000 клеток до 225 000 клеток) и отдельного этапа подготовки библиотеки перед секвенированием9. С другой стороны, протокол ATAC-seq относительно прост и требует небольшого количества ячеек (<50 000 ячеек)10. В отличие от методов FAIRE-seq и DNase-seq, подготовка библиотеки секвенирования ATAC-seq относительно проста, так как изолированный образец ДНК уже помечен адаптерами секвенирования Tn5. Таким образом, для завершения подготовки библиотеки требуется только этап амплификации ПЦР с соответствующими праймерами, а предварительные этапы обработки, такие как конечный ремонт и лигирование адаптера, не должны выполняться, что экономит время11. Во-вторых, ATAC-seq позволяет избежать необходимости конверсии, клонирования и усиления бисульфита с помощью региональных праймеров, необходимых для MAPit7. Благодаря этим преимуществам ATAC-seq стал чрезвычайно популярным методом определения открытых областей хроматина. Хотя метод ATAC-seq прост, несколько шагов требуют оптимизации для получения высококачественных и воспроизводимых данных. В этой рукописи обсуждаются процедуры оптимизации для подготовки стандартной библиотеки ATAC-seq, особенно выделяются три параметра: (1) состав буфера лизиса, (2) концентрация транспозазы Tn5 и (3) номер клетки. Кроме того, в данной работе приведены примеры данных из условий оптимизации с использованием как раковых, так и нераковых адгезивных эпителиальных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq широко используется для картирования открытых и активных областей хроматина. Прогрессирование раковых клеток часто обусловлено генетическими изменениями и эпигенетическим перепрограммированием, что приводит к изменению доступности хроматина и экспрессии генов. Пример такого …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с признательностью выражаем признательность механизму UND Genomics Core за выдающуюся техническую помощь.
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] и стартовыми фондами, предоставленными Школой медицины и наук о здоровье Университета Северной Дакоты, Департамент биомедицинских наук [до M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
