ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung
Summary
ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.
Abstract
Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.
Introduction
Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala1. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs 2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, und der Schwerpunkt dieser Arbeit, ATAC-seq (Assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartiert zugängliche Regionen durch die Verwendung eines Schlüsselmerkmals von DNase, nämlich der bevorzugten Verdauung von nackter DNA, die frei von Histonen und anderen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren5 ist. FAIRE-seq, ähnlich wie ChIP-seq, nutzt Formaldehydvernetzung und Beschallung, außer dass keine Immunpräzipitation beteiligt ist, und die nukleosomenfreien Regionen werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert6. Die MAPit-Methode verwendet eine GC-Methyltransferase, um die Chromatinstruktur bei Einzelmolekülauflösung7 zu untersuchen. ATAC-seq basiert auf der hyperaktiven Transposase Tn58. Die Tn5-Transposase bindet bevorzugt an offene Chromatinbereiche und fügt Sequenzierungsadapter in zugängliche Bereiche ein. Tn5 arbeitet durch einen DNA-vermittelten “Cut and Paste”-Mechanismus, wobei die mit Adaptern vorgeladene Transposase an offene Chromatinstellen bindet, DNA schneidet und die Adapter8 ligiert. Tn5-gebundene Regionen werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern wiederhergestellt, die an diese Adapter angeglüht werden. FAIRE-seq und DNase-seq erfordern eine große Menge an Ausgangsmaterial (~100.000 Zellen bis 225.000 Zellen) und einen separaten Bibliotheksvorbereitungsschritt vor der Sequenzierung9. Auf der anderen Seite ist das ATAC-seq-Protokoll relativ einfach und erfordert eine kleine Anzahl von Zellen (<50.000 Zellen)10. Im Gegensatz zu den FAIRE-seq- und DNase-seq-Techniken ist die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung von ATAC-seq relativ einfach, da die isolierte DNA-Probe bereits mit den Sequenzierungsadaptern von Tn5 markiert wird. Daher ist nur der PCR-Amplifikationsschritt mit geeigneten Primern erforderlich, um die Bibliotheksvorbereitung abzuschließen, und die vorherigen Verarbeitungsschritte wie Endreparatur und Adapterligatur müssen nicht durchgeführt werden, was Zeit spart11. Zweitens vermeidet ATAC-seq die Notwendigkeit einer Bisulfitumwandlung, Klonierung und Amplifikation mit regionsspezifischen Primern, die für MAPit7 erforderlich sind. Aufgrund dieser Vorteile ist ATAC-seq zu einer sehr beliebten Methode zur Definition offener Chromatinregionen geworden. Obwohl die ATAC-seq-Methode einfach ist, erfordern mehrere Schritte eine Optimierung, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Dieses Manuskript diskutiert Optimierungsverfahren für die Standard-ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung und hebt insbesondere drei Parameter hervor: (1) Lysepufferzusammensetzung, (2) Tn5-Transposase-Konzentration und (3) Zellzahl. Darüber hinaus liefert dieser Artikel Beispieldaten aus den Optimierungsbedingungen unter Verwendung von krebsartigen und nicht-kanzerösen adhärenten Epithelzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogramm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der UND Genomics Core Facility für die hervorragende technische Unterstützung.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [P20GM104360 bis M.T., P20 GM104360 bis A.D.] und Anschubfonds der University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [bis M.T.] finanziert.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
