אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן
Summary
ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.
Abstract
הבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) בודקת נגישות של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) באמצעות טרנספוזאז Tn5 היפראקטיבי. Tn5 חותך ומתיר מתאמי לריצוף בתפוקה גבוהה באזורי כרומטין נגישים. בתאים אאוקריוטים, הדנ”א הגנומי נארז בכרומטין, קומפלקס של דנ”א, היסטונים וחלבונים אחרים, המשמש כמחסום פיזי למנגנון השעתוק. בתגובה לאותות חיצוניים, גורמי שעתוק מגייסים קומפלקסים לעיצוב מחדש של כרומטין כדי לאפשר גישה למנגנוני השעתוק להפעלת גנים. לכן, זיהוי אזורי כרומטין פתוחים שימושי בעת ניטור פעילויות משפר ומקדם גנים במהלך אירועים ביולוגיים כגון התקדמות הסרטן. מכיוון שפרוטוקול זה קל לשימוש ויש לו דרישת קלט תאים נמוכה, ATAC-seq אומץ באופן נרחב כדי להגדיר אזורי כרומטין פתוחים בסוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים. לרכישת נתונים מוצלחת, יש לקחת בחשבון מספר פרמטרים בעת הכנת ספריות ATAC-seq. ביניהם, הבחירה של חיץ תזה תאים, טיטרציה של אנזים Tn5, ואת נפח ההתחלה של תאים חיוניים להכנת ספריית ATAC-seq בתאים סרטניים. אופטימיזציה חיונית ליצירת נתונים באיכות גבוהה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של שיטות האופטימיזציה של ATAC-seq עבור סוגי תאי אפיתל.
Introduction
נגישות כרומטין היא דרישת מפתח לוויסות ביטוי גנים בקנה מידה גנומירחב 1. שינויים בנגישות הכרומטין קשורים לעתים קרובות למספר מצבי מחלה, כולל סרטן 2,3,4. במהלך השנים פותחו טכניקות רבות המאפשרות לחוקרים לחקור את נוף הכרומטין על ידי מיפוי אזורים של נגישות כרומטין. חלקם כוללים את DNase-seq (ריצוף אתרים רגישים ל-DNase I)5, FAIRE-seq (בידוד בסיוע פורמלדהיד של אלמנטים רגולטוריים)6, MAPit (פרוטוקול נגישות מתיל-טרנספראז לתבניות בודדות)7, והמוקד של מאמר זה, ATAC-seq (בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז)8. DNase-seq ממפה אזורים נגישים על ידי שימוש בתכונה מרכזית של DNase, כלומר עיכול מועדף של דנ”א עירום ללא היסטונים וחלבונים אחרים כגון גורמי שעתוק5. FAIRE-seq, בדומה ל-ChIP-seq, משתמש בהצלבת פורמלדהיד ובסוניקציה, למעט העובדה שאין צורך במיצוי חיסוני, והאזורים נטולי הנוקלאוזומים מבודדים על ידי מיצוי פנול-כלורופורם6. שיטת MAPit משתמשת במתיל-טרנספראז GC כדי לחקור את מבנה הכרומטין ברזולוציה של מולקולה בודדת7. ATAC-seq מסתמך על הטרנספוזאז ההיפראקטיבי, Tn58. הטרנספוזאז Tn5 נקשר באופן מועדף לאזורי כרומטין פתוחים ומכניס מתאמי ריצוף לאזורים נגישים. Tn5 פועל באמצעות מנגנון “גזור והדבק” בתיווך DNA, לפיו הטרנספוזאז הטעון מראש במתאמים נקשר לאתרי כרומטין פתוחים, חותך דנ”א ומקפיץ את המתאמים8. אזורים מאוגדים Tn5 משוחזרים על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים המתאימים למתאמים אלה. FAIRE-seq ו- DNase-seq דורשים כמות גדולה של חומר מוצא (~ 100,000 תאים עד 225,000 תאים) ושלב הכנה נפרד של הספרייה לפני ריצוף9. מצד שני, פרוטוקול ATAC-seq הוא פשוט יחסית ודורש מספר קטן של תאים (<50,000 תאים)10. שלא כמו טכניקות FAIRE-seq ו- DNase-seq, הכנת ספריית הריצוף של ATAC-seq קלה יחסית, מכיוון שדגימת ה- DNA המבודדת כבר מתויגת עם מתאמי הריצוף על ידי Tn5. לכן, יש צורך רק בשלב ההגברה של ה-PCR עם פריימרים מתאימים כדי להשלים את הכנת הספרייה, ואין צורך לבצע את שלבי העיבוד הקודמים כגון תיקון קצה וקשירת מתאם, ובכך לחסוך זמן11. שנית, ATAC-seq מונע את הצורך בהמרה, שיבוט והגברה של ביסולפיטים עם פריימרים ספציפיים לאזור הנדרשים עבור MAPit7. בשל יתרונות אלה, ATAC-seq הפך לשיטה פופולרית מאוד להגדרת אזורי כרומטין פתוחים. למרות ששיטת ATAC-seq פשוטה, שלבים מרובים דורשים אופטימיזציה כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה וניתנים לשחזור. כתב יד זה דן בהליכי אופטימיזציה להכנת ספריית ATAC-seq סטנדרטית, במיוחד תוך הדגשת שלושה פרמטרים: (1) הרכב חיץ תזה, (2) ריכוז טרנספוזאז Tn5, ו-(3) מספר תא. בנוסף, מאמר זה מספק נתונים לדוגמה מתנאי האופטימיזציה תוך שימוש הן בתאי אפיתל סרטניים והן בתאי אפיתל שאינם סרטניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq נמצא בשימוש נרחב למיפוי אזורי כרומטין פתוחים ופעילים. התקדמות התאים הסרטניים מונעת לעתים קרובות על ידי שינויים גנטיים ותכנות מחדש אפיגנטי, וכתוצאה מכך משתנה נגישות הכרומטין וביטוי הגנים. דוגמה לתכנות מחדש זה נראית במהלך המעבר האפיתל למזנכימלי (EMT) והתהליך ההפוך שלו, מעבר מזנכימלי לא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן הליבה הגנומית של UND על הסיוע הטכני יוצא הדופן.
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [P20GM104360 עד M.T., P20 GM104360 עד A.D.] וקרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי בית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת צפון דקוטה, המחלקה למדעים ביו-רפואיים [ל- M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
