Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro
Summary
ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell’accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.
Abstract
Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) sonda l’accessibilità dell’acido desossiribonucleico (DNA) utilizzando la trasposasi Tn5 iperattiva. Tn5 taglia e lega gli adattatori per il sequenziamento ad alta produttività all’interno di regioni di cromatina accessibili. Nelle cellule eucariotiche, il DNA genomico è impacchettato in cromatina, un complesso di DNA, istoni e altre proteine, che funge da barriera fisica al meccanismo trascrizionale. In risposta a segnali estrinseci, i fattori di trascrizione reclutano complessi di rimodellamento della cromatina per consentire l’accesso al meccanismo trascrizionale per l’attivazione genica. Pertanto, l’identificazione delle regioni aperte della cromatina è utile quando si monitorano le attività del potenziatore e del promotore genico durante eventi biologici come la progressione del cancro. Poiché questo protocollo è facile da usare e ha un basso requisito di input cellulare, ATAC-seq è stato ampiamente adottato per definire regioni aperte della cromatina in vari tipi di cellule, comprese le cellule tumorali. Per una corretta acquisizione dei dati, è necessario considerare diversi parametri durante la preparazione delle librerie ATAC-seq. Tra questi, la scelta del tampone di lisi cellulare, la titolazione dell’enzima Tn5 e il volume iniziale delle cellule sono cruciali per la preparazione della libreria ATAC-seq nelle cellule tumorali. L’ottimizzazione è essenziale per generare dati di alta qualità. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei metodi di ottimizzazione ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.
Introduction
L’accessibilità della cromatina è un requisito chiave per la regolazione dell’espressione genica su scala genomica1. I cambiamenti nell’accessibilità della cromatina sono frequentemente associati a diversi stati patologici, incluso il cancro 2,3,4. Nel corso degli anni, sono state sviluppate numerose tecniche per consentire ai ricercatori di sondare il paesaggio della cromatina mappando le regioni di accessibilità della cromatina. Alcuni di essi includono DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7 e il focus di questo articolo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mappa le regioni accessibili impiegando una caratteristica chiave della DNasi, vale a dire la digestione preferenziale del DNA nudo privo di istoni e altre proteine come i fattori di trascrizione5. FAIRE-seq, simile a ChIP-seq, utilizza la reticolazione e la sonicazione della formaldeide, tranne che non è coinvolta alcuna immunoprecipitazione e le regioni prive di nucleosomi sono isolate mediante estrazione fenolo-cloroformio6. Il metodo MAPit utilizza una metiltransferasi GC per sondare la struttura della cromatinaalla risoluzione 7 della singola molecola. ATAC-seq si basa sulla trasposasi iperattiva, Tn58. La trasposasi Tn5 si lega preferenzialmente alle regioni aperte della cromatina e inserisce adattatori di sequenziamento in regioni accessibili. Tn5 opera attraverso un meccanismo “taglia e incolla” mediato dal DNA, in base al quale la trasposasi precaricata con adattatori si lega ai siti aperti della cromatina, taglia il DNA e lega gli adattatori8. Le regioni legate a Tn5 vengono recuperate mediante amplificazione PCR utilizzando primer che ricottura a questi adattatori. FAIRE-seq e DNase-seq richiedono una grande quantità di materiale di partenza (~ 100.000 celle a 225.000 celle) e una fase di preparazione della libreria separata prima del sequenziamento9. D’altra parte, il protocollo ATAC-seq è relativamente semplice e richiede un piccolo numero di cellule (<50.000 cellule)10. A differenza delle tecniche FAIRE-seq e DNase-seq, la preparazione della libreria di sequenziamento di ATAC-seq è relativamente semplice, poiché il campione di DNA isolato viene già taggato con gli adattatori di sequenziamento da Tn5. Pertanto, è necessaria solo la fase di amplificazione PCR con primer appropriati per completare la preparazione della libreria e non è necessario eseguire le fasi di elaborazione precedenti come la riparazione finale e la legatura dell’adattatore, risparmiando così tempo11. In secondo luogo, ATAC-seq evita la necessità di conversione, clonazione e amplificazione del bisolfito con primer specifici per regione richiesti per MAPit7. Grazie a questi vantaggi, ATAC-seq è diventato un metodo estremamente popolare per definire regioni di cromatina aperte. Sebbene il metodo ATAC-seq sia semplice, più passaggi richiedono l’ottimizzazione per ottenere dati di alta qualità e riproducibili. Questo manoscritto discute le procedure di ottimizzazione per la preparazione della libreria ATAC-seq standard, evidenziando in particolare tre parametri: (1) composizione del tampone di lisi, (2) concentrazione di Tn5 trasposasi e (3) numero di cellule. Inoltre, questo documento fornisce dati di esempio dalle condizioni di ottimizzazione utilizzando cellule epiteliali aderenti sia cancerose che non cancerose.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq è stato ampiamente utilizzato per mappare regioni di cromatina aperte e attive. La progressione delle cellule tumorali è spesso guidata da alterazioni genetiche e riprogrammazione epigenetica, con conseguente alterazione dell’accessibilità della cromatina e dell’espressione genica. Un esempio di questa riprogrammazione è visto durante la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e il suo processo inverso, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che sono noti per essere processi chiave di riprogrammazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine la struttura UND Genomics Core per l’eccezionale assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] e dai fondi start-up forniti dalla University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [to M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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