Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer
Summary
ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.
Abstract
El ensayo para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) sondea la accesibilidad del ácido desoxirribonucleico (ADN) utilizando la transposasa Tn5 hiperactiva. Tn5 corta y liga adaptadores para secuenciación de alto rendimiento dentro de regiones de cromatina accesibles. En las células eucariotas, el ADN genómico se empaqueta en cromatina, un complejo de ADN, histonas y otras proteínas, que actúa como una barrera física para la maquinaria transcripcional. En respuesta a las señales extrínsecas, los factores de transcripción reclutan complejos de remodelación de la cromatina para permitir el acceso a la maquinaria transcripcional para la activación génica. Por lo tanto, la identificación de regiones abiertas de cromatina es útil cuando se monitorean las actividades potenciadoras y promotoras de genes durante eventos biológicos como la progresión del cáncer. Dado que este protocolo es fácil de usar y tiene un bajo requerimiento de entrada celular, ATAC-seq ha sido ampliamente adoptado para definir regiones abiertas de cromatina en varios tipos de células, incluidas las células cancerosas. Para una adquisición de datos exitosa, se deben considerar varios parámetros al preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre ellos, la elección del tampón de lisis celular, la titulación de la enzima Tn5 y el volumen inicial de células son cruciales para la preparación de la biblioteca ATAC-seq en células cancerosas. La optimización es esencial para generar datos de alta calidad. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los métodos de optimización ATAC-seq para tipos de células epiteliales.
Introduction
La accesibilidad a la cromatina es un requisito clave para la regulación de la expresión génica a escala de todo el genoma1. Los cambios en la accesibilidad a la cromatina se asocian frecuentemente con varios estados de enfermedad, incluyendo el cáncer 2,3,4. A lo largo de los años, se han desarrollado numerosas técnicas para permitir a los investigadores sondear el paisaje de la cromatina mediante el mapeo de regiones de accesibilidad a la cromatina. Algunos de ellos incluyen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, y el foco de este trabajo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mapea regiones accesibles empleando una característica clave de DNasa, a saber, la digestión preferencial de ADN desnudo libre de histonas y otras proteínas como los factores de transcripción5. FAIRE-seq, similar a ChIP-seq, utiliza reticulación y sonicación de formaldehído, excepto que no hay inmunoprecipitación involucrada, y las regiones libres de nucleosomas se aíslan por extracción de fenol-cloroformo6. El método MAPit utiliza una metiltransferasa GC para sondear la estructura de la cromatina a una resolución de molécula única7. ATAC-seq se basa en la transposasa hiperactiva, Tn58. La transposasa Tn5 se une preferentemente a regiones de cromatina abiertas e inserta adaptadores de secuenciación en regiones accesibles. Tn5 opera a través de un mecanismo de “cortar y pegar” mediado por ADN, mediante el cual la transposasa precargada con adaptadores se une a sitios abiertos de cromatina, corta el ADN y liga los adaptadores8. Las regiones unidas a Tn5 se recuperan mediante amplificación por PCR utilizando cebadores que se unen a estos adaptadores. FAIRE-seq y DNase-seq requieren una gran cantidad de material de partida (~ 100,000 celdas a 225,000 células) y un paso separado de preparación de la biblioteca antes de la secuenciación9. Por otro lado, el protocolo ATAC-seq es relativamente simple y requiere un pequeño número de celdas (<50.000 células)10. A diferencia de las técnicas FAIRE-seq y DNase-seq, la preparación de la biblioteca de secuenciación de ATAC-seq es relativamente fácil, ya que la muestra de ADN aislada ya está siendo etiquetada con los adaptadores de secuenciación por Tn5. Por lo tanto, solo se necesita el paso de amplificación por PCR con cebadores apropiados para completar la preparación de la biblioteca, y no es necesario realizar los pasos de procesamiento previos, como la reparación final y la ligadura del adaptador, ahorrando así tiempo11. En segundo lugar, ATAC-seq evita la necesidad de conversión, clonación y amplificación de bisulfito con cebadores específicos de la región requeridos para MAPit7. Debido a estas ventajas, ATAC-seq se ha convertido en un método muy popular para definir regiones de cromatina abierta. Aunque el método ATAC-seq es simple, varios pasos requieren optimización para obtener datos de alta calidad y reproducibles. Este manuscrito discute los procedimientos de optimización para la preparación estándar de la biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente tres parámetros: (1) composición del tampón de lisis, (2) concentración de transposasa Tn5 y (3) número de células. Además, este documento proporciona datos de ejemplo de las condiciones de optimización utilizando células epiteliales adherentes cancerosas y no cancerosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq ha sido ampliamente utilizado para mapear regiones de cromatina abiertas y activas. La progresión de las células cancerosas es frecuentemente impulsada por alteraciones genéticas y reprogramación epigenética, lo que resulta en una alteración de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica. Un ejemplo de esta reprogramación se observa durante la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y su proceso inverso, la transición mesenquimal a epitelial (MET), que se sabe que son procesos clave de reprog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la instalación UND Genomics Core por su excelente asistencia técnica.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] y los fondos iniciales proporcionados por la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad de Dakota del Norte, Departamento de Ciencias Biomédicas [a M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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