تحسين ATAC-Seq لأبحاث علم التخلق السرطاني
Summary
ATAC-seq هي طريقة تسلسل الحمض النووي التي تستخدم ترانسبوزاز الطافر مفرط النشاط ، Tn5 ، لتعيين التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بوساطة عوامل النسخ. يتيح ATAC-seq اكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التغيرات المظهرية في الخلايا السرطانية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات التحسين ل ATAC-seq في أنواع الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا السرطانية.
Abstract
فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) يسبر إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) باستخدام ترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط. يقوم Tn5 بقطع وربط المحولات للتسلسل عالي الإنتاجية داخل مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها. في الخلايا حقيقية النواة، يحزم الحمض النووي الجينومي في الكروماتين، وهو مركب من الحمض النووي (DNA) والهستونات والبروتينات الأخرى، التي تعمل كحاجز مادي أمام آلية النسخ. استجابة للإشارات الخارجية ، تقوم عوامل النسخ بتجنيد مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين لتمكين الوصول إلى آلية النسخ لتنشيط الجينات. لذلك ، فإن تحديد مناطق الكروماتين المفتوحة مفيد عند مراقبة أنشطة المحسن والمروج الجيني أثناء الأحداث البيولوجية مثل تطور السرطان. نظرا لأن هذا البروتوكول سهل الاستخدام وله متطلبات إدخال خلية منخفضة ، فقد تم اعتماد ATAC-seq على نطاق واسع لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة في أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. للحصول على البيانات بنجاح ، يجب مراعاة العديد من المعلمات عند إعداد مكتبات ATAC-seq. من بينها ، يعد اختيار المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، ومعايرة إنزيم Tn5 ، وحجم بدء الخلايا أمرا بالغ الأهمية لإعداد مكتبة ATAC-seq في الخلايا السرطانية. التحسين ضروري لإنشاء بيانات عالية الجودة. هنا ، نقدم وصفا تفصيليا لطرق تحسين ATAC-seq لأنواع الخلايا الظهارية.
Introduction
تعد إمكانية الوصول إلى الكروماتين مطلبا رئيسيا لتنظيم التعبير الجيني على نطاق الجينوم1. غالبا ما ترتبط التغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين بالعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان2،3،4. على مر السنين ، تم تطوير العديد من التقنيات لتمكين الباحثين من استكشاف مشهد الكروماتين عن طريق رسم خرائط لمناطق إمكانية الوصول إلى الكروماتين. بعضها يشمل DNase-seq (تسلسل المواقع شديدة الحساسية DNase I)5 ، FAIRE-seq (عزل العناصر التنظيمية بمساعدة الفورمالديهايد)6 ، MAPit (بروتوكول إمكانية الوصول إلى ميثيل ترانسفيراز للقوالب الفردية)7 ، ومحور هذه الورقة ، ATAC-seq (مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase)8. يرسم DNase-seq خرائط للمناطق التي يمكن الوصول إليها من خلال استخدام ميزة رئيسية ل DNase ، وهي الهضم التفضيلي للحمض النووي العاري الخالي من الهستونات والبروتينات الأخرى مثل عوامل النسخ5. يستخدم FAIRE-seq ، على غرار ChIP-seq ، تشابك الفورمالديهايد وصوتنة ، باستثناء عدم وجود ترسيب مناعي ، ويتم عزل المناطق الخالية من النيوكليوسوم عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم6. تستخدم طريقة MAPit GC methyltransferase لفحص بنية الكروماتين بدقة جزيء واحد7. يعتمد ATAC-seq على ناقل الحركة مفرط النشاط ، Tn58. يرتبط ترانسبوزاز Tn5 بشكل تفضيلي بمناطق الكروماتين المفتوحة ويدخل محولات التسلسل في المناطق التي يمكن الوصول إليها. يعمل Tn5 من خلال آلية “قص ولصق” بوساطة الحمض النووي ، حيث يرتبط الترانسبوزاز المحمل مسبقا بالمحولات بمواقع الكروماتين المفتوحة ، ويقطع الحمض النووي ، ويربط المحولات8. يتم استرداد المناطق المرتبطة ب Tn5 عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي تلتصق بهذه المحولات. يتطلب FAIRE-seq و DNase-seq كمية كبيرة من المواد الأولية (~ 100000 خلية إلى 225000 خلية) وخطوة إعداد مكتبة منفصلة قبل التسلسل9. من ناحية أخرى ، فإن بروتوكول ATAC-seq بسيط نسبيا ويتطلب عددا صغيرا من الخلايا (<50000 خلية)10. على عكس تقنيات FAIRE-seq و DNase-seq ، فإن إعداد مكتبة التسلسل ل ATAC-seq سهل نسبيا ، حيث يتم بالفعل تمييز عينة الحمض النووي المعزولة بمحولات التسلسل بواسطة Tn5. لذلك ، لا يلزم سوى خطوة تضخيم PCR مع البادئات المناسبة لإكمال إعداد المكتبة ، ولا يلزم تنفيذ خطوات المعالجة السابقة مثل الإصلاح النهائي وربط المحول ، وبالتالي توفير الوقت11. ثانيا ، يتجنب ATAC-seq الحاجة إلى تحويل ثنائي الكبريتيت واستنساخه وتضخيمه باستخدام مواد أولية خاصة بالمنطقة مطلوبة ل MAPit7. بسبب هذه المزايا ، أصبح ATAC-seq طريقة شائعة للغاية لتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة. على الرغم من أن طريقة ATAC-seq بسيطة ، إلا أن الخطوات المتعددة تتطلب التحسين للحصول على بيانات عالية الجودة وقابلة للتكرار. تناقش هذه المخطوطة إجراءات التحسين لإعداد مكتبة ATAC-seq القياسية ، ولا سيما تسليط الضوء على ثلاثة معلمات: (1) تكوين المخزن المؤقت للتحلل ، (2) تركيز ترانسبوزاز Tn5 ، و (3) رقم الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة أمثلة على البيانات من ظروف التحسين باستخدام كل من الخلايا الظهارية الملتصقة السرطانية وغير السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام ATAC-seq على نطاق واسع لرسم خرائط مناطق الكروماتين المفتوحة والنشطة. غالبا ما يكون تقدم الخلايا السرطانية مدفوعا بالتغيرات الجينية وإعادة البرمجة اللاجينية ، مما يؤدي إلى تغيير إمكانية الوصول إلى الكروماتين والتعبير الجيني. يظهر مثال على إعادة البرمجة هذه أثناء الانتقال من الظها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعرب عن امتناننا لمرفق UND Genomics Core للمساعدة التقنية المتميزة.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [P20GM104360 إلى M.T. ، P20 GM104360 إلى AD] وأموال البدء المقدمة من كلية الطب والعلوم الصحية بجامعة نورث داكوتا ، قسم العلوم الطبية الحيوية [إلى M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
