ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek
Summary
ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.
Abstract
De test voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) onderzoekt de toegankelijkheid van desoxyribonucleïnezuur (DNA) met behulp van het hyperactieve Tn5-transposase. Tn5 snijdt en ligeert adapters voor high-throughput sequencing binnen toegankelijke chromatinegebieden. In eukaryote cellen is genomisch DNA verpakt in chromatine, een complex van DNA, histonen en andere eiwitten, dat fungeert als een fysieke barrière voor de transcriptionele machinerie. Als reactie op extrinsieke signalen rekruteren transcriptiefactoren chromatineremodelleringscomplexen om toegang tot de transcriptionele machinerie mogelijk te maken voor genactivering. Daarom is het identificeren van open chromatinegebieden nuttig bij het monitoren van versterker- en genpromotoractiviteiten tijdens biologische gebeurtenissen zoals kankerprogressie. Omdat dit protocol gemakkelijk te gebruiken is en een lage celinvoervereiste heeft, is ATAC-seq op grote schaal gebruikt om open chromatinegebieden in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, te definiëren. Voor succesvolle data-acquisitie moeten verschillende parameters worden overwogen bij het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken. Onder hen zijn de keuze van de cellysebuffer, de titratie van het Tn5-enzym en het startvolume van cellen cruciaal voor de atac-seq-bibliotheekvoorbereiding in kankercellen. Optimalisatie is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de ATAC-seq-optimalisatiemethoden voor epitheelceltypen.
Introduction
Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke vereiste voor de regulatie van genexpressie op een genoombrede schaal1. Veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine worden vaak geassocieerd met verschillende ziektetoestanden, waaronder kanker 2,3,4. In de loop der jaren zijn tal van technieken ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen het chromatinelandschap te onderzoeken door gebieden van chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen. Sommigen van hen omvatten DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, en de focus van dit artikel, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq brengt toegankelijke gebieden in kaart door gebruik te maken van een belangrijk kenmerk van DNase, namelijk de preferentiële vertering van naakt DNA vrij van histonen en andere eiwitten zoals transcriptiefactoren5. FAIRE-seq, vergelijkbaar met ChIP-seq, maakt gebruik van formaldehyde crosslinking en sonicatie, behalve dat er geen immunoprecipitatie bij betrokken is en de nucleosoomvrije regio’s worden geïsoleerd door fenol-chloroformextractie6. De MAPit-methode maakt gebruik van een GC-methyltransferase om de chromatinestructuur te testen met een resolutie van één molecuul7. ATAC-seq vertrouwt op de hyperactieve transposase, Tn58. De Tn5 transposase bindt bij voorkeur aan open chromatinegebieden en plaatst sequencingadapters in toegankelijke gebieden. Tn5 werkt via een DNA-gemedieerd “knip en plak” mechanisme, waarbij de transposase vooraf geladen met adapters bindt aan open chromatine sites, knipt DNA en ligeert de adapters8. Tn5-gebonden gebieden worden hersteld door PCR-versterking met behulp van primers die naar deze adapters gloeien. FAIRE-seq en DNase-seq vereisen een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal (~ 100.000 cellen tot 225.000 cellen) en een afzonderlijke bibliotheekvoorbereidingsstap voordat9 wordt gesequenceerd. Aan de andere kant is het ATAC-seq-protocol relatief eenvoudig en vereist het een klein aantal cellen (<50.000 cellen)10. In tegenstelling tot de FAIRE-seq- en DNase-seq-technieken is de sequencingbibliotheekvoorbereiding van ATAC-seq relatief eenvoudig, omdat het geïsoleerde DNA-monster al door Tn5 wordt getagd met de sequencingadapters. Daarom is alleen de PCR-versterkingsstap met de juiste primers nodig om de bibliotheekvoorbereiding te voltooien en hoeven de voorafgaande verwerkingsstappen zoals eindreparatie en adapterligatie niet te worden uitgevoerd, waardoor tijd wordt bespaard11. Ten tweede vermijdt ATAC-seq de noodzaak van bisulfietconversie, klonen en versterking met regiospecifieke primers die vereist zijn voor MAPit7. Vanwege deze voordelen is ATAC-seq een enorm populaire methode geworden voor het definiëren van open chromatinegebieden. Hoewel de ATAC-seq-methode eenvoudig is, vereisen meerdere stappen optimalisatie om hoogwaardige en reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Dit manuscript bespreekt optimalisatieprocedures voor standaard ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding, met name drie parameters: (1) lysisbuffersamenstelling, (2) Tn5-transposaseconcentratie en (3) celnummer. Daarnaast biedt dit artikel voorbeeldgegevens van de optimalisatieomstandigheden met behulp van zowel kankerachtige als niet-kankerachtige aanhangende epitheelcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq is op grote schaal gebruikt voor het in kaart brengen van open en actieve chromatinegebieden. De progressie van kankercellen wordt vaak aangedreven door genetische veranderingen en epigenetische herprogrammering, wat resulteert in veranderde chromatinetoegankelijkheid en genexpressie. Een voorbeeld van deze herprogrammering wordt gezien tijdens de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) en het omgekeerde proces, mesenchymale naar epitheliale overgang (MET), waarvan bekend is dat het belangrijke cellulaire h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de UND Genomics Core-faciliteit voor uitstekende technische assistentie.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health [P20GM104360 tot M.T., P20 GM104360 tot A.D.] en start-upfondsen verstrekt door de University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [tot M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
