Optimisation ATAC-Seq pour la recherche en épigénétique du cancer
Summary
ATAC-seq est une méthode de séquençage de l’ADN qui utilise la transposase mutante hyperactive, Tn5, pour cartographier les changements dans l’accessibilité de la chromatine médiés par des facteurs de transcription. ATAC-seq permet la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux altérations phénotypiques dans les cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les procédures d’optimisation pour ATAC-seq dans les types de cellules épithéliales, y compris les cellules cancéreuses.
Abstract
Le test de chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) sonde l’accessibilité de l’acide désoxyribonucléique (ADN) à l’aide de la transposase Tn5 hyperactive. Tn5 coupe et ligature les adaptateurs pour un séquençage à haut débit dans les régions de chromatine accessibles. Dans les cellules eucaryotes, l’ADN génomique est emballé dans la chromatine, un complexe d’ADN, d’histones et d’autres protéines, qui agit comme une barrière physique à la machinerie transcriptionnelle. En réponse aux signaux extrinsèques, les facteurs de transcription recrutent des complexes de remodelage de la chromatine pour permettre l’accès à la machinerie transcriptionnelle pour l’activation des gènes. Par conséquent, l’identification des régions ouvertes de la chromatine est utile lors de la surveillance des activités des amplificateurs et des promoteurs de gènes lors d’événements biologiques tels que la progression du cancer. Étant donné que ce protocole est facile à utiliser et nécessite peu d’entrée cellulaire, ATAC-seq a été largement adopté pour définir des régions de chromatine ouvertes dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses. Pour une acquisition de données réussie, plusieurs paramètres doivent être pris en compte lors de la préparation des bibliothèques ATAC-seq. Parmi eux, le choix du tampon de lyse cellulaire, le titrage de l’enzyme Tn5 et le volume de départ des cellules sont cruciaux pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans les cellules cancéreuses. L’optimisation est essentielle pour générer des données de haute qualité. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodes d’optimisation ATAC-seq pour les types de cellules épithéliales.
Introduction
L’accessibilité de la chromatine est une exigence clé pour la régulation de l’expression génique à l’échelle du génome1. Les changements dans l’accessibilité de la chromatine sont fréquemment associés à plusieurs états pathologiques, y compris le cancer 2,3,4. Au fil des ans, de nombreuses techniques ont été développées pour permettre aux chercheurs de sonder le paysage de la chromatine en cartographiant les régions d’accessibilité de la chromatine. Certains d’entre eux incluent DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, et l’objet de cet article, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq cartographie les régions accessibles en utilisant une caractéristique clé de DNase, à savoir la digestion préférentielle de l’ADN nu exempt d’histones et d’autres protéines telles que les facteurs de transcription5. FAIRE-seq, similaire à ChIP-seq, utilise la réticulation et la sonication du formaldéhyde, sauf qu’aucune immunoprécipitation n’est impliquée, et les régions exemptes de nucléosomes sont isolées par extraction phénol-chloroforme6. La méthode MAPit utilise une méthyltransférase GC pour sonder la structure de la chromatine à une résolutionde 7 molécule unique. ATAC-seq s’appuie sur la transposase hyperactive, Tn58. La transposase Tn5 se lie préférentiellement aux régions de chromatine ouvertes et insère des adaptateurs de séquençage dans les régions accessibles. Tn5 fonctionne par un mécanisme de « copier-coller » médié par l’ADN, par lequel la transposase préchargée avec des adaptateurs se lie aux sites de chromatine ouverts, coupe l’ADN et ligature les adaptateurs8. Les régions liées à Tn5 sont récupérées par amplification PCR à l’aide d’amorces qui recuisent ces adaptateurs. FAIRE-seq et DNase-seq nécessitent une grande quantité de matériel de départ (~100 000 cellules à 225 000 cellules) et une étape de préparation de bibliothèque séparée avant le séquençage9. D’autre part, le protocole ATAC-seq est relativement simple et nécessite un petit nombre de cellules (<50 000 cellules)10. Contrairement aux techniques FAIRE-seq et DNase-seq, la préparation de la bibliothèque de séquençage d’ATAC-seq est relativement facile, car l’échantillon d’ADN isolé est déjà étiqueté avec les adaptateurs de séquençage par Tn5. Par conséquent, seule l’étape d’amplification PCR avec les amorces appropriées est nécessaire pour terminer la préparation de la bibliothèque, et les étapes de traitement préalables telles que la réparation finale et la ligature de l’adaptateur ne doivent pas être effectuées, ce qui permet de gagner du temps11. Deuxièmement, ATAC-seq évite le besoin de conversion, de clonage et d’amplification du bisulfite avec des amorces spécifiques à la région requises pour MAPit7. En raison de ces avantages, ATAC-seq est devenu une méthode extrêmement populaire pour définir des régions de chromatine ouvertes. Bien que la méthode ATAC-seq soit simple, plusieurs étapes nécessitent une optimisation pour obtenir des données de haute qualité et reproductibles. Ce manuscrit traite des procédures d’optimisation pour la préparation de bibliothèques ATAC-seq standard, en mettant particulièrement l’accent sur trois paramètres: (1) la composition du tampon de lyse, (2) la concentration de la transposase Tn5 et (3) le nombre de cellules. En outre, cet article fournit des exemples de données sur les conditions d’optimisation utilisant des cellules épithéliales adhérentes cancéreuses et non cancéreuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq a été largement utilisé pour cartographier les régions de chromatine ouvertes et actives. La progression des cellules cancéreuses est souvent provoquée par des altérations génétiques et une reprogrammation épigénétique, ce qui entraîne une altération de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression des gènes. Un exemple de cette reprogrammation est observé au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et de son processus inverse, la transition mésenchymateuse-épithéli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’installation UND Genomics Core pour son assistance technique exceptionnelle.
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health [P20GM104360 à M.T., P20 GM104360 à A.D.] et des fonds de démarrage fournis par l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université du Dakota du Nord, Département des sciences biomédicales [à M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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