Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.
Kimyasal gradyanlar tarafından lökosit rehberliği, immün yanıtlar için gereklidir. Nötrofiller, önemli antimikrobiyal işlevleri yerine getirdikleri doku hasarı bölgelerine alınan ilk hücrelerdir. Bu lokuslara yapılan kaçakçılık, kemokinler de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar kemoattractantlar tarafından düzenlenmektedir. Moleküler düzeyde, kemoattractant sinyalleme, karşılık gelen reseptörlerin hücre içi trafiği ile düzenlenir. Bununla birlikte, kemokin reseptörlerindeki hücre altı değişikliklerin hücre ve doku düzeyinde lökosit migrasyon dinamiklerini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Burada, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerde kemokin reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu araçlar, zebra balığı nötrofillerinde diferansiyel kemokin reseptörü kaçakçılığının, doku hasarı bölgelerinde nötrofil kümelenmesini ve dağılmasını koordine ettiğini ortaya koymuştur. Bunun, enflamatuar yanıtların kendi kendine nasıl çözüldüğünü anlamamız için etkileri vardır. Tarif edilen araçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda nötrofil göç paternlerini anlamak için kullanılabilir ve metodoloji diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir.
Lökosit göçü immün yanıtlar için büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık hücreleri, dokuları ve kan damarlarını geçebilen ve mikroplara veya diğer önemli konakçı hücrelere doğru yönlü olarak göç etmek için bir dizi kimyasal rehberlik ipucunu algılayabilen prototipik göçmen hücrelerdir. Doğru rehberlik, kemokinlerin en belirgin kategori1’i temsil ettiği kemoattractantların tanınmasına dayanır. Kemokinler, oldukça spesifik yedi transmembran G protein eşleşmiş reseptörleri tarafından tanınır. Kemokin bağlanması üzerine, kemokin reseptörleri, ilişkili trimerik G proteinlerinin aktivasyonuna ve bunların sitoiskelet değişikliklerini ve yönlendirilmiş migrasyonunu destekleyen fonksiyonel sinyal alt birimlerine ayrışmasına yol açan konformasyonu değiştirir1. İkincil olarak, kemokin reseptörleri fosforile edilir ve bu modifikasyon, cezbedici için duyarsızlaştırmaya yol açar, bunu hızlı yeniden duyarlılaştırma / geri dönüşüm veya hücre içi bozunma ve hücre yüzeyinden aşağı regülasyonizleyebilir 2. Bu reseptör dinamikleri, hücreler tarafından alınan sinyallemenin süresini ve dozunu etkiler, ancak lökosit migrasyon davranışını nasıl etkilediklerini in vivo olarak aydınlatmak zor olmuştur.
Geleneksel memeli sistemlerinde canlı lökositlerdeki reseptör dinamiklerinin izlenmesi çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Canlı çalışmalar için, floresan proteinlerle reseptör füzyonları hücrelerde eksprese edilmelidir. Bu, birincil lökositlerde, özellikle nötrofillerde zordur ve şimdiye kadar yapılan çalışmalar, kemokin reseptörlerini 3,4 eksprese etmek için vekil nötrofil hücre hatlarını kullanmıştır. Lökositlerin bilgilendirici kaçakçılık kusurları5,6 olan bir floresan reseptörü veya mutant reseptörleri eksprese ettiği transgenik fare modellerinin oluşturulması, önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı gerektirir. Bu durumlarda bile, canlı hayvanda görüntüleme reseptör dinamikleri için görüntüleme çözünürlüğü ve kontrastı sınırlı olabilir ve çalışmalar sabit doku kesitleri5’te immünohistokimyayı kullanmıştır. Bu teknik zorluklar göz önüne alındığında, kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı bir doku ortamında hücre davranışını nasıl etkilediğine dair anlayışımız şu anda sınırlıdır.
Burada, zebra balığı nötrofillerinde reseptör kaçakçılığını izlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Zebra balığı, fareler gibi genetik olarak izlenebilir, ancak transgenez, verimli transpozon sistemleri ve doğrudan zigot manipülasyonu7 kullanılarak nispeten daha basittir. Şeffaf larva ideal olarak görüntülemeye uygundur. Kemokin reseptör dinamikleri, primordiyan germ hücrelerinde ve lateral line primordiumda, floresan muhabirler 8,9,10 ile karşılık gelen füzyonların ekspresyonu ile görselleştirilmiştir. Zebra balığı larvaları, memeli nötrofillerine göre oldukça korunmuş genetik ve hücresel özelliklere sahip olgun nötrofiller ile donatılmıştır. Sitoiskelet dinamiği ve polarite düzenleyicileri gibi hücre altı sinyal dinamikleri, bu hücrelerde karşılık gelen transgenik çizgilerin üretilmesiyle görselleştirilmiştir11,12,13. Son zamanlarda, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerdeki kemokin reseptör dinamiklerini görselleştirdik ve fonksiyonel olarak analiz ettik14. Burada, nötrofillerde kemokin sinyalizasyonu için transgenik muhabir hatlarının üretimini, canlı görüntüleme için embriyoların hazırlanmasını, nötrofil sinyallemesini incelemek için bir yara tahlili ve görüntülerin elde edilmesi ve analizi için protokolü açıklıyoruz. Ayrıca, aday ligandlara kemokin reseptör yanıtlarını test etmek için bir yan protokol sağlıyoruz, bu da karakterize edilmemiş reseptörlerde ligand tanıma paternleri oluşturmaya çalışırken yararlıdır. Bu teknikler, endojen kemokin ekspresyonunun inhibisyonu veya değiştirilmiş ligand kaynaklı kaçakçılık ile mutant reseptörlerin üretilmesi gibi daha ileri genetik manipülasyonlarla kombinasyon halinde, spesifik sinyal dinamiklerinin lökosit davranışını in vivo olarak nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilir. Floresan etiketli kemokin reseptörlerini ifade eden transgenik çizgiler, doğrudan antikor boyama ile tespit edilmesi zor olan endojen kemokin gradyanları için muhabir olarak da kullanılabilir. Açıklanan metodoloji, muhabirlerin üretimini diğer immüno-sinyal reseptörlerine genişletmek için kapsam sağlar.
Tarif edilen yöntem, doku hasarına inflamatuar yanıt sırasında endojen ligandlara in situ yanıt olarak reseptör dinamiklerinin canlı görüntülenmesini sağlar. Cxcr1 / Cxcr2 nötrofil muhabirlerinin kullanımı, enfeksiyon, tümör modelleri veya diğer doku hasarı türleri gibi diğer fizyolojik ortamlara genişletilebilir 14,25,26,27. Ek olarak, endojen reseptörün eksojen bir mutant reseptör tarafından bastırıldığı ve kurtarıldığı transgenik kurtarma hatları, immün yanıtlarda spesifik nötrofil migrasyon paternlerinin önemini incelemek için yararlı araçlar sağlayabilir. Örneğin, duyarsızlaştırmayı bozan Cxcr1 reseptör mutantları, enflamatuar bölgelerde daha belirgin nötrofil kümelenmesine neden olur14. Bu fonksiyon kazancı fenotipi, nötrofil cemaatinin farklı fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için kullanılabilir, örneğin, yara onarımı, bulaşıcı hastalık veya tümör evrimi ve kompleman reseptör nakavt / nakavt deneyleri. Metodoloji ayrıca mevcut muhabirlerin aralığını genişletmek için bir temel sağlar. Floresan muhabir seçimi dikkate alınması önemlidir ve biyolojik soruya bağlıdır. Nötrofillerdeki bu kemokin reseptörlerinin kurucu döngüsünün, epitel hücrelerine kıyasla yüksek olduğunu ve hızlı olgunlaşması olan muhabirlerin (örneğin, sfGFP) membran seviyelerini kararlı durumda bildirmeleri ve nötrofil stimülasyonuüzerindeki farklılıkları çözmeleri gerektiğini bulduk8,14. Bu nedenle, sfGFP / tagRFP’nin membran oranları, bu hücre tipinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi ölçmek için geçerli değildir, ancak tagRFP paterni, bazı çalışmalarda yararlı olabilecek reseptörün hücre içi kaderlerinin izlenmesine izin verir. Ayrıca, tagRFP’nin daha konsantre hücre içi sinyalinin bireysel larvaları taramak için yararlı olduğunu bulduk. Plazma zarındaki reseptör seviyelerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, nötrofillerdeki bir floresan membran belirtecini aynı transgen9’da veya bağımsız bir transgen14’te birlikte eksprese etmek olacaktır. Önceki senaryoda, transgen balığın taranması için ek bir araç sağlayacak ve ekspresyon seviyeleri belirteç ve reseptör arasında karşılaştırılabilir olacaktır. İkinci yaklaşım daha modüler olacaktır, çünkü bir reseptör muhabiri olan bir zebra balığı çizgisi farklı muhabir hatlarıyla birleştirilebilir. Her iki durumda da, kümelenmiş nötrofillerde reseptör seviyelerinin membran nicelleştirilmesinin zor olduğunu belirtmek gerekir (aşağıya bakınız). Son olarak, bu protokolün olası bir uzantısının, daha ayrıntılı lokalizasyon analizleri için canlı görüntülemeyi immünohistokimya ile takip etmek olacağını not ediyoruz.
Tol2 transgenez sistemi iyi kurulmuş7’dir ve lizozim C promotörü nötrofil ekspresyonu11,15 için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, transgenez yaklaşımı nispeten basittir ve bu promotör ile elde edilen ekspresyon seviyesi, reseptör dinamiklerinin analizi için yeterli kontrast sağlayacak kadar yüksektir. Olası bir sınırlama, ekspresyon seviyesinin endojen reseptör ekspresyon seviyelerini özetlememesidir. Yeni CRISPR teknolojileri, özellikle ilgi çekici reseptörler için zincirleme hatlar oluşturmak üzere konuşlandırılabilir28. Bu teknolojiler hala hantaldır ve hücre altı görüntüleme için gerekli ekspresyon seviyelerini garanti etmeyebilir, ancak başarılı gelişimleri endojen sinyal dinamiklerini anlamak için önemli bir atılım olacaktır. Fonksiyonel doğrulamalar, transgenik reseptör yapıları ile verilerin yorumlanması için önemlidir. Örneğin, floresan füzyon proteininin işlevsel olduğunu belirlemek için ligand tanıma testleri kullanılabilir ve transgenik nötrofil ekspresyon seviyelerinin işlevsellik14 ile uyumlu olduğunu belirlemek için nakavt fenotiplerinin kurtarılması kullanılabilir. Son olarak, reseptör füzyonunu doğrulamanın daha doğrudan bir yolu, etiketlenmemiş versiyonlar14’ün yanı sıra etiketli reseptörlü in vitro fonksiyonel bir tahlil kullanmak olacaktır.
Niceleme yaklaşımı, nötrofillerde in vivo olarak doğru membran segmentasyonundaki spesifik zorlukları ele almaktadır. Epitel niteliğindeki hücrelerde, membran reseptör seviyelerinin normalleştirilmesi, membran reseptör seviyelerinin bir kontrol belirtecine normalleştirilmesiyle otomatik olarak gerçekleştirilebilir, bu da tandem veya ayrı ayrı ifade edilebilir9. Gerçekten de, gastrulating embriyolarında ligand tanıma testini kullanırken böyle bir yaklaşım uyguladık14. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo hücre şeklinde karmaşık, hızlı değişikliklere uğrar ve membran segmentasyonunu hem 2D hem de 3D14’te zorlaştırır. Bu, birçok fizyolojik ortamda meydana gelen nötrofiller kümelendiğinde daha da zordur29. Kontrast metrik, membran segmentasyonu gerektirmediği, bunun yerine hücredeki reseptör dağılımının genel durumunu yansıttığı için bu sınırlamanın üstesinden gelir (membranöz / pürüzsüz vs veziküler / noktalı). Kontrast metriğinin görüntünün genel kontrastından etkilenebileceğine dikkat etmek önemlidir, bu nedenle farklı embriyolarda / örneklerde sinyalin değişkenliğini hesaba katmak için bireysel hücre değerlerinin dahili bir referansa normalleştirilmesi gerekir. Örneğin, CHT’deki yanıt vermeyen nötrofillerin ortalama hücre kontrast değerini kullandık (yani, sabit kalan ve ventral yüzgecine göç etmeyen nötrofiller)14. Ek bir olasılık, aynı hücredeki bir kontrol işaretçisinin kontrast değerleriyle normalleştirmek olacaktır. Bu, yanıt vermeyen hücrelerin dahili bir referansı mevcut olmadığında bir çözüm sağlayacaktır ve muhtemelen farklı koşullar arasındaki reseptör dinamiklerindeki daha ince nicel farklılıkları çözebilir.
Görüntülemenin yeri dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Burada ventral yüzgeç yarasının seçilmesinin nedeni, daha yaygın olarak kullanılan kuyruk yüzgeci yara modeli16,30’un aksine, yaralama yerinin nötrofil ikametgahı / göçmen kökenli bölgeye yakın olmasıdır. Bu, nötrofillerin gelmesi nispeten az zaman aldığı için tahlilin zaman çizelgesini hızlandırır. Ek olarak, hem göç kaynağında (CHT) hem de ilgilenilen hedef konumda (yara) hücre davranışını yakalama fırsatı sağlar. Bu burada önemlidir, çünkü hücre altı görüntüleme için gereken uzamsal ve zamansal çözünürlüğün geniş bir görüş alanı veya çok konumlu tarama ile birleştirilmesi zordur. Bu nedenle, ventral yüzgeç yara testi, göç orijininden göç yanıtının evriminin izlenmesine ve yanıt vermeyen hücrelerdeki spesifik olmayan reseptör dalgalanmalarının eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi, ikincisi, spesifik olmayan dinamikler için dahili bir referans sağladığı için niceleme amaçları için yararlıdır. Diğer sistemlerde, böyle bir iç referansa sahip olmak mümkün olmayabilir, bu durumda birlikte ifade edilen bir membran işaretleyicisinin kontrast değerleri alternatif bir kontrol sağlayacaktır.
Özetle, metodolojinin diğer sistemlere uygulanabilir olduğunu ve çeşitli amaçlar için konuşlandırılabileceğini öngörüyoruz. Örneğin, aynı muhabirler enfeksiyon ayarları veya diğer hastalık modelleri gibi diğer enflamatuar ortamlarda kullanılabilir. Zebra balığı reseptör raporlayıcı hatlarının repertuarı, sinyal mekanizmalarını anlamak veya ligand dinamiklerini in vivo olarak bildirmek için diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir. Yaklaşım, gözlemlenen dinamiklerin mekanik temelini sorgulamak için nakavt / nakavt teknikleriyle birleştirilebilir. Örneğin, ligand ekspresyonunun pertürbasyonu, gözlemlenen reseptör dinamikleri için ligand bağımlılığını gösterebilir. Gelecekte, sistemin muhabirlerin zincirleme olarak yerleştirilmesini içerecek şekilde daha da rafine edilebileceğini öngörüyoruz. Nihayetinde, bu metodolojiyi kullanan bulgular, memelilerde bu sinyal reseptörlerinin korunması ve bu çalışmaların daha büyük organizmalarda yürütülmesinin göreceli zorluğu göz önüne alındığında, zebra balığı topluluğunun ötesinde değerli yeni bilgiler sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Christine Holt ve Bill Harris’e konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Floresan zamanlayıcı omurga yapıları için Darren Gilmour’a ve Tol2-Lyz omurga vektörü için Anna Huttenlocher’e teşekkür ederiz. Steve Renshaw’a Tg(mpx:GFP)i114 serisi için teşekkür ederiz. Bu çalışma MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] ve bir Isaac Newton Trust hibesi 19.23(n). C.C., MRC DTP öğrenciliği ve kısmen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] tarafından desteklendi; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe. H.W. MRC DTP Studentship tarafından desteklendi. H.P., Wellcome Trust doktora hibesi (105391 / Z / 14 / Z) ve kısmen bir Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z] tarafından desteklenmiştir; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe ve MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |