Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra
La guía de leucocitos por gradientes químicos es esencial para las respuestas inmunes. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas en sitios de daño tisular donde ejecutan funciones antimicrobianas cruciales. Su tráfico a estos loci está orquestado por varios quimioatrayentes inflamatorios, incluidas las quimiocinas. A nivel molecular, la señalización quimioatrayente está regulada por el tráfico intracelular de los receptores correspondientes. Sin embargo, no está claro cómo los cambios subcelulares en los receptores de quimiocinas afectan la dinámica de migración de leucocitos a nivel celular y tisular. Aquí describimos una metodología para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante las respuestas inflamatorias al daño tisular. Estas herramientas han revelado que el tráfico diferencial de receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra coordina la agrupación y dispersión de neutrófilos en sitios de daño tisular. Esto tiene implicaciones para nuestra comprensión de cómo las respuestas inflamatorias se auto-resuelven. Las herramientas descritas podrían utilizarse para comprender los patrones de migración de neutrófilos en una variedad de entornos fisiológicos y patológicos y la metodología podría ampliarse a otros receptores de señalización.
La migración de leucocitos es de suma importancia para las respuestas inmunes. Las células inmunes son células migratorias prototípicas, que son notablemente capaces de atravesar tejidos y vasos sanguíneos y detectar una serie de señales de guía química para migrar direccionalmente hacia microbios u otras células huésped de importancia. La orientación correcta se basa en el reconocimiento de quimioatrayentes, entre los cuales las quimiocinas representan la categoría1 más prominente. Las quimiocinas son reconocidas por receptores altamente específicos acoplados a la proteína G de siete transmembranas. Tras la unión a quimiocinas, los receptores de quimiocinas cambian la conformación, lo que lleva a la activación de las proteínas G triméricas asociadas y su disociación en subunidades de señalización funcional que promueven cambios citoesqueléticos y migración dirigida1. Secundariamente, los receptores de quimiocinas están fosforilados, y esta modificación conduce a la desensibilización al atrayente, que puede ser seguida por una rápida resensibilización / reciclaje o degradación intracelular y regulación descendente de la superficie celular2. Esta dinámica de los receptores influye en la duración y la dosis de señalización recibida por las células, pero la forma en que afectan el comportamiento de migración de leucocitos ha sido difícil de dilucidar in vivo.
El seguimiento de la dinámica de los receptores en leucocitos vivos en sistemas tradicionales de mamíferos se enfrenta a varios desafíos. Para los estudios en vivo, las fusiones de receptores con proteínas fluorescentes deben expresarse en las células. Esto es un desafío en los leucocitos primarios, particularmente en neutrófilos, y los estudios hasta ahora han utilizado líneas celulares de neutrófilos sustitutos para expresar los receptores de quimiocinas 3,4. La generación de modelos de ratón transgénico, en los que los leucocitos expresan un receptor fluorescente o receptores mutantes con defectos de tráfico informativos 5,6, conlleva una considerable inversión de tiempo y recursos. Incluso en estos casos, la resolución de imágenes y el contraste para la dinámica de los receptores de imágenes en el animal vivo pueden ser limitados y los estudios han utilizado inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo5. Dados estos desafíos técnicos, nuestra comprensión de cómo la dinámica de los receptores quimioatrayentes afecta el comportamiento celular en un entorno de tejido vivo es actualmente limitada.
Aquí proporcionamos una metodología para monitorear el tráfico de receptores en neutrófilos de pez cebra. Los peces cebra son genéticamente tratables, como los ratones, pero la transgénesis es relativamente más sencilla mediante el uso de sistemas de transposones eficientes y la manipulación directa decigotos 7. La larva transparente es idealmente susceptible de imágenes. La dinámica del receptor de quimiocinas se ha visualizado en células germinales primordiales y en la línea lateral primordium mediante la expresión de fusiones correspondientes con reporteros fluorescentes 8,9,10. Las larvas de pez cebra están equipadas con neutrófilos maduros que tienen propiedades genéticas y celulares altamente conservadas con respecto a los neutrófilos de mamíferos. La dinámica de señalización subcelular como la dinámica citoesquelética y los reguladores de polaridad se han visualizado en estas células mediante la generación de las líneas transgénicas correspondientes 11,12,13. Recientemente, visualizamos y analizamos funcionalmente la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante el curso de las respuestas inflamatorias al daño tisular14. Aquí, describimos la generación de líneas reporteras transgénicas para la señalización de quimiocinas en neutrófilos, la preparación de embriones para imágenes en vivo, un ensayo de heridas para el estudio de la señalización de neutrófilos y el protocolo para la adquisición y análisis de imágenes. También proporcionamos un protocolo lateral para probar las respuestas de los receptores de quimiocinas a los ligandos candidatos, que es útil cuando se trata de establecer patrones de reconocimiento de ligandos en receptores no caracterizados. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación con otras manipulaciones genéticas, como la inhibición de la expresión endógena de quimiocinas o la generación de receptores mutantes con tráfico alterado inducido por ligandos, para interrogar cómo la dinámica de señalización específica afecta el comportamiento de los leucocitos in vivo. Las líneas transgénicas que expresan receptores de quimiocinas marcados fluorescentemente también se pueden usar como reporteros para gradientes endógenos de quimiocinas, que de otro modo son difíciles de detectar por tinción directa de anticuerpos. La metodología descrita proporciona un margen para ampliar la generación de reporteros a otros receptores de inmunocopuntía.
El método descrito permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los receptores en respuesta a ligandos endógenos in situ durante una respuesta inflamatoria al daño tisular. El uso de reporteros de neutrófilos Cxcr1/Cxcr2 podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como infecciones, modelos tumorales u otros tipos de daño tisular 14,25,26,27. Además, las líneas de rescate transgénico, en las que el receptor endógeno es suprimido y rescatado por un receptor mutante exógeno, podrían proporcionar herramientas útiles para diseccionar la importancia de los patrones específicos de migración de neutrófilos en las respuestas inmunes. Por ejemplo, los mutantes del receptor Cxcr1 que tienen una desensibilización deteriorada causan agrupamiento de neutrófilos más prominente en los sitios inflamatorios14. Esta ganancia de fenotipo de función podría usarse para comprender el papel de la congregación de neutrófilos en diferentes procesos fisiológicos, por ejemplo, reparación de heridas, enfermedades infecciosas o evolución tumoral, y experimentos de derribo / eliminación de receptores del complemento. La metodología también proporciona una base para ampliar la gama de reporteros disponibles. La elección del reportero fluorescente es importante de considerar y depende de la cuestión biológica. Encontramos que el recambio constitutivo de estos receptores de quimiocinas en neutrófilos fue alto, en comparación con las células epiteliales, y que los reporteros con maduración rápida (p.ej., sfGFP) debían informar los niveles de membrana en estado estacionario y resolver las diferencias tras la estimulación de neutrófilos 8,14. Por lo tanto, las proporciones de membrana de sfGFP / tagRFP no son aplicables para medir la internalización inducida por ligandos en este tipo de célula, pero el patrón de tagRFP permite el seguimiento de los destinos intracelulares del receptor, lo que podría ser útil en algunos estudios. También encontramos que la señal intracelular más concentrada de tagRFP es útil para la detección de larvas individuales. Un enfoque alternativo para medir los niveles de receptores en la membrana plasmática sería coexpresar un marcador de membrana fluorescente en neutrófilos, ya sea en el mismo transgén9 o en un transgén14 independiente. En el primer escenario, el transgén proporcionaría un medio adicional para examinar a los peces y los niveles de expresión serían comparables entre el marcador y el receptor. Este último enfoque sería más modular, ya que una línea de pez cebra con un reportero receptor podría combinarse con diferentes líneas de reportero. En cualquier caso, vale la pena señalar que la cuantificación de la membrana de los niveles del receptor es un desafío en los neutrófilos agrupados (ver más abajo). Finalmente, observamos que una posible extensión de este protocolo sería hacer un seguimiento de las imágenes en vivo por inmunohistoquímica para análisis de localización más detallados.
El sistema de transgénesis Tol2 está bien establecido7 y el promotor de lisozima C se ha utilizado ampliamente para la expresión de neutrófilos11,15. El enfoque de transgénesis es, por lo tanto, relativamente sencillo y el nivel de expresión alcanzado con este promotor es lo suficientemente alto como para proporcionar suficiente contraste para el análisis de la dinámica del receptor. Una posible limitación es que el nivel de expresión no recapitula los niveles de expresión del receptor endógeno. Se podrían implementar nuevas tecnologías CRISPR para establecer líneas de llamada para receptores de particular interés28. Estas tecnologías siguen siendo engorrosas y pueden no garantizar los niveles de expresión requeridos para las imágenes subcelulares, pero su desarrollo exitoso sería un avance importante para comprender la dinámica de señalización endógena. Las validaciones funcionales son importantes para interpretar los datos con construcciones de receptores transgénicos. Por ejemplo, los ensayos de reconocimiento de ligandos se pueden utilizar para establecer que la proteína de fusión fluorescente es funcional y el rescate de fenotipos knockout podría utilizarse para establecer que los niveles de expresión de neutrófilos transgénicos son compatibles con la funcionalidad14. Finalmente, una forma más directa de validar la fusión del receptor sería utilizar un ensayo funcional in vitro con receptor etiquetado junto con las versiones no marcadas14.
El enfoque de cuantificación aborda dificultades específicas en la segmentación precisa de la membrana en neutrófilos in vivo. En células de naturaleza epitelial, la cuantificación de los niveles de receptores se puede ejecutar automáticamente normalizando los niveles de receptores de membrana a un marcador de control, que se puede expresar en tándem o por separado9. De hecho, hemos aplicado este enfoque, al utilizar el ensayo de reconocimiento de ligandos en embriones gastrulatantes14. Sin embargo, los neutrófilos experimentan cambios complejos y rápidos en la forma de la célula in vivo, lo que dificulta la segmentación de la membrana tanto en 2D como en 3D14. Esto es aún más difícil cuando los neutrófilos se agrupan, lo que ocurre en muchos entornos fisiológicos29. La métrica de contraste supera esta limitación, ya que no requiere segmentación de membrana, sino que refleja el estado general de distribución del receptor en la célula (membranoso / liso vs vesicular / puntiagudo). Es importante tener en cuenta que la métrica de contraste puede verse afectada por el contraste general de la imagen, por lo que se requiere la normalización de los valores celulares individuales a una referencia interna para tener en cuenta la variabilidad de la señal en diferentes embriones / muestras. Por ejemplo, utilizamos el valor medio de contraste celular de neutrófilos no sensibles en la CHT (es decir, neutrófilos que permanecen estacionarios y no migran a la aleta ventral)14. Una posibilidad adicional sería normalizar con valores de contraste de un marcador de control en la misma celda. Esto proporcionaría una solución cuando no se dispone de una referencia interna de células que no responden y es probable que resuelva diferencias cuantitativas más finas en la dinámica del receptor entre diferentes afecciones.
La ubicación de las imágenes es otra variable a considerar. La razón para elegir la herida de la aleta ventral aquí, a diferencia del modelo de herida de la aleta caudal más comúnmente utilizado16,30, es porque el sitio de la herida está cerca del sitio de residencia de neutrófilos / origen migratorio. Esto acelera la línea de tiempo del ensayo, ya que los neutrófilos tardan relativamente poco tiempo en llegar. Además, brinda la oportunidad de capturar el comportamiento celular tanto en el origen de la migración (CHT) como en la ubicación objetivo de interés (herida). Esto es relevante aquí, porque la resolución espacial y temporal requerida para las imágenes subcelulares es difícil de combinar con un gran campo de visión o escaneo de múltiples posiciones. Así, el ensayo de herida de aleta ventral permite rastrear la evolución de la respuesta migratoria desde el origen migratorio y la captura simultánea de fluctuaciones inespecíficas del receptor en células que no responden. Como se mencionó anteriormente, este último es útil para fines de cuantificación, ya que proporciona una referencia interna para dinámicas inespecíficas. En otros sistemas, puede que no sea posible disponer de una referencia interna de este tipo, en cuyo caso los valores de contraste de un marcador de membrana coexpresado proporcionarían un control alternativo.
En resumen, anticipamos que la metodología es aplicable a otros sistemas y se puede implementar para una variedad de propósitos. Por ejemplo, los mismos reporteros podrían utilizarse en otros entornos inflamatorios, como entornos de infección u otros modelos de enfermedad. El repertorio de líneas reporteras de receptores de pez cebra podría ampliarse a otros receptores de señalización, para comprender los mecanismos de señalización o informar sobre la dinámica del ligando in vivo. El enfoque se puede combinar con técnicas de derribo / nocaut para interrogar la base mecanicista de la dinámica observada. Por ejemplo, la perturbación de la expresión del ligando puede indicar la dependencia del ligando para la dinámica del receptor observada. En el futuro, prevemos que el sistema podría perfeccionarse aún más para incorporar la inserción de reporteros. En última instancia, los hallazgos que utilizan esta metodología proporcionarían nuevos conocimientos valiosos más allá de la comunidad del pez cebra, dada la conservación de estos receptores de señalización en mamíferos y el desafío relativo de realizar estos estudios en organismos más grandes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Christine Holt y Bill Harris por su ayuda con la microscopía confocal. Agradecemos a Darren Gilmour por las construcciones de la columna vertebral del temporizador fluorescente y a Anna Huttenlocher por el vector de la columna vertebral Tol2-Lyz. Agradecemos a Steve Renshaw por la línea Tg(mpx:GFP)i114 . Esta labor contó con el apoyo del MRC (MR/L019523/1), el Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y una subvención de Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. contó con el apoyo de una beca de MRC DTP y en parte del Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvención. H.W. fue apoyado por un MRC DTP Studentship. H.P. fue apoyado por una beca de doctorado de Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) y en parte por un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Subvención del Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y el MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |