כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי זברה
הדרכת לויקוציטים על ידי שיפועים כימיים חיונית לתגובות חיסוניות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שגויסו לאתרים של נזק לרקמות שבהם הם מבצעים פונקציות מיקרוביאלית קריטיות. הסחר שלהם בלוקים אלה מתוזמר על ידי כמה כימותרפיה דלקתית, כולל כימותרפיה. ברמה המולקולרית, איתות כימותרפי מוסדר על ידי סחר תאי של הקולטנים המתאימים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים תת-תאיים בקולטני כימוקין משפיעים על דינמיקת נדידת לויקוציטים ברמת התא והרקמות. כאן אנו מתארים מתודולוגיה להדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקה קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות. כלים אלה חשפו כי דיפרנציאל chemokine קולטן סחר נויטרופילים נויטרופילים מתאם קיבוץ נויטרופילים ופיזור באתרים של נזק לרקמות. יש לכך השלכות על הבנתנו כיצד תגובות דלקתיות נפתרות מעצמן. הכלים המתוארים יכולים לשמש להבנת דפוסי נדידת נויטרופילים במגוון הגדרות פיזיולוגיות ופתולוגיות וניתן להרחיב את המתודולוגיה לקולטנים אחרים של איתות.
נדידת לויקוציטים היא בעלת חשיבות עליונה לתגובות חיסוניות. תאי מערכת החיסון הם תאי נדידה טיפוסיים, המסוגלים להפליא לחצות רקמות וכלי דם ולחוש מגוון של רמזי הדרכה כימיים לנדוד לכיוון חיידקים או תאים מארחים אחרים בעלי חשיבות. הדרכה נכונה מסתמכת על ההכרה של כימותרפיה, ביניהם כימותרפיה מייצגת את הקטגוריה הבולטת ביותר1. כימותרפיה מזוהה על ידי קולטנים ספציפיים מאוד של חלבון 7 transmembrane G. עם כריכת כימוקין, קולטני כימוקין משנים קונפורמציה המובילה להפעלה של חלבוני G טרימריים הקשורים ואת הניתוק שלהם לתת-יחידות איתות פונקציונליות המקדמות שינויים ציטו-שלדיים ונדידה מכוונת1. משנית, קולטני chemokine הם זרחן, ושינוי זה מוביל desensitization למשוך, אשר יכול להיות ואחריו רגישות מחדש מהירה / מיחזור או השפלה תאית ורגולציה למטה מפני השטח של התא2. דינמיקה קולטן אלה להשפיע על משך ומינון של איתות שהתקבלו על ידי התאים אבל איך הם משפיעים על התנהגות הגירת לויקוציטים היה קשה להבהיר ב vivo.
מעקב אחר דינמיקת קולטנים בלוקוציטים חיים במערכות יונקים מסורתיות מתמודד עם מספר אתגרים. עבור מחקרים חיים, היתוך קולטן עם חלבונים פלואורסצנטיים חייב לבוא לידי ביטוי בתאים. זה מאתגר בלוקוציטים ראשוניים, במיוחד בנויטרופילים, ומחקרים עד כה השתמשו בקווי תאי נויטרופיל פונדקאיים כדי לבטא קולטני כימוקין 3,4. דור של מודלים עכבר מהונדסים, שבו לויקוציטים מבטאים קולטן פלואורסצנטי או קולטנים מוטנטיים עם פגמים מסחריים אינפורמטיביים 5,6, כרוך בהשקעה ניכרת של זמן ומשאבים. גם במקרים אלה, רזולוציית ההדמיה והניגודיות לדינמיקה של קולטן הדמיה בבעלי החיים יכולה להיות מוגבלת ומחקרים השתמשו באימונוהיסטוכימיה בקטעי רקמות קבועות5. בהתחשב באתגרים טכניים אלה, ההבנה שלנו כיצד דינמיקת קולטנים כימותרפיים משפיעה על התנהגות התאים בסביבת רקמות חיות מוגבלת כיום.
כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור סחר בקולטן בנויטרופילים של דגי זברה. דגי זברה ניתנים למתיחה גנטית, כמו עכברים, אך טרנסגנזה היא יחסית פשוטה יותר באמצעות שימוש במערכות טרנספוזון יעילות ומניפולציה ישירה של זיגוטה7. הזחל השקוף מקובל באופן אידיאלי על הדמיה. הדינמיקה קולטן chemokine כבר דמיינו בתאי נבט קדמוניים ואת פרימוריום הקו לרוחב על ידי ביטוי של היתוך המתאים עם כתבים פלואורסצנטיים 8,9,10. זחלי דגי זברה מצוידים בנויטרופילים בוגרים בעלי תכונות גנטיות ותאיות שמורות מאוד ביחס לנויטרופילים של יונקים. דינמיקת איתות תת-תאית כגון דינמיקת שלד ציטוספת שלד ורגולטורים של קוטביות כבר דמיינו בתאים אלה על ידי הדור של קווים מהונדסים מתאימים 11,12,13. לאחרונה, דמיינו וניתחנו פונקציונלית דינמיקה של קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות14. כאן, אנו מתארים את הדור של קווי כתב מהונדסים לאיתות כימוקין בנויטרופילים, הכנת עוברים להדמיה חיה, בדיקת פצעים לחקר איתות נויטרופילים והפרוטוקול לרכישה וניתוח של תמונות. אנו מספקים גם פרוטוקול צדדי כדי לבדוק תגובות קולטן chemokine ליגנדים מועמדים, אשר שימושי בעת ניסיון להקים דפוסי זיהוי ליגנד בקולטנים לא אופייניים. טכניקות אלה ניתן להשתמש בשילוב עם מניפולציות גנטיות נוספות, כגון עיכוב של ביטוי כימוקין אנדוגני או דור של קולטנים מוטנטיים עם סחר מושרה ליגנד שונה, כדי לחקור כיצד דינמיקת איתות ספציפית להשפיע על התנהגות לויקוציטים ב vivo. הקווים הטרנסגניים המבטאים קולטני chemokine מתויגים פלואורסצנטית יכולים לשמש גם ככתבים עבור שיפועים כימוקין אנדוגני, אשר אחרת קשה לזהות על ידי כתמי נוגדנים ישירים. המתודולוגיה המתוארת מספקת היקף להרחבת דור הכתבים לקולטנים אחרים של איתות חיסוני.
השיטה המתוארת מאפשרת הדמיה חיה של דינמיקת הקולטן בתגובה לליגנדים אנדוגניים במקום במהלך תגובה דלקתית לנזק לרקמות. השימוש בכתבי נויטרופילים Cxcr1/Cxcr2 יכול להיות מורחב להגדרות פיזיולוגיות אחרות, כגון זיהום, מודלים של גידולים או סוגים אחרים של נזק לרקמות 14,25,26,27. בנוסף, קווי הצלה מהונדסים, שבהם הקולטן האנדוגני מדוכא ומציל על ידי קולטן מוטציה אקסוגנית, יכולים לספק כלים שימושיים לנתח את החשיבות של דפוסי נדידת נויטרופילים ספציפיים בתגובות חיסוניות. לדוגמה, מוטציות קולטן Cxcr1 אשר לקוי desensitization לגרום קיבוץ נויטרופילים בולט יותר באתרים דלקתיים14. רווח זה של פנוטיפ פונקציה יכול לשמש כדי להבין את התפקיד של קהילת נויטרופילים בתהליכים פיזיולוגיים שונים, למשל, תיקון פצעים, מחלה זיהומית, או התפתחות הגידול, ולהשלים את הקולטן knockdown / ניסויי נוקאאוט. המתודולוגיה מספקת גם בסיס להרחבת מגוון הכתבים הזמינים. הבחירה של כתב פלואורסצנטי חשוב לשקול ותלוי בשאלה הביולוגית. מצאנו כי המחזור המכונן של קולטני כימוקין אלה בנויטרופילים היה גבוה, בהשוואה לתאי אפיתל, וכי כתבים עם התבגרות מהירה (למשל, sfGFP) נדרשו לדווח על רמות הממברנה במצב יציב ולפתור הבדלים על גירוי נויטרופיל 8,14. לכן, יחסי ממברנה של sfGFP / tagRFP אינם ישימים למדידת הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד בסוג תא זה, אבל התבנית של tagRFP מאפשר מעקב אחר גורלות תאיים של הקולטן, אשר יכול להיות שימושי במחקרים מסוימים. מצאנו גם כי האות התאי המרוכז יותר של tagRFP שימושי לסינון זחלים בודדים. גישה חלופית למדידת רמות הקולטן בקרום הפלזמה תהיה לבטא במשותף סמן קרום פלואורסצנטי בנויטרופילים או באותו טרנסג’ן9 או בטרנסג’ן עצמאי14. בתרחיש הקודם הטרנסג’ן יספק אמצעי נוסף לסינון הדגים ורמות הביטוי יהיו דומות בין הסמן לקולטן. הגישה השנייה תהיה מודולרית יותר, בכך שקו דגי זברה עם כתב קולטן יכול להיות משולב עם קווים עיתונאיים שונים. בכל מקרה, ראוי לציין כי כימות הממברנה של רמות הקולטן מאתגר נויטרופילים מקובצים באשכולות (ראה להלן). לבסוף, נציין כי הרחבה אפשרית של פרוטוקול זה תהיה לעקוב אחר ההדמיה החיה על ידי אימונוהיסטוכימיה לניתוחי לוקליזציה מפורטים יותר.
מערכת Transgenesis Tol2 מבוססת היטב7 ומקדם lysozyme C שימש בהרחבה לביטוי נויטרופיל11,15. הגישה הטרנסגנזה היא, אם כן, פשוטה יחסית ורמת הביטוי שהושגה עם מקדם זה גבוהה מספיק כדי לספק ניגודיות מספקת לניתוח דינמיקת הקולטן. מגבלה אפשרית היא שרמת הביטוי אינה מסכמת מחדש את רמות הביטוי של קולטן אנדוגני. טכנולוגיות CRISPR חדשות ניתן לפרוס כדי להקים קווי נוק-אין עבור קולטנים של עניין מסוים28. טכנולוגיות אלה עדיין מסורבלות וייתכן שאינן מבטיחות את רמות הביטוי הנדרשות להדמיה תת-תאית, אך פיתוחן המוצלח יהווה פריצת דרך חשובה להבנת דינמיקת האיתות האנדוגנית. אימותים פונקציונליים חשובים לפענוח נתונים עם מבני קולטן מהונדסים. לדוגמה, ניתן להשתמש בבדיקות זיהוי ליגנד כדי לקבוע כי חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי הוא פונקציונלי והצלה של פנוטיפים נוקאאוט יכול לשמש כדי לקבוע כי רמות ביטוי נויטרופיל מהונדס תואמות לפונקציונליות14. לבסוף, דרך ישירה יותר לאמת את היתוך הקולטן יהיה לנצל בדיקה פונקציונלית במבחנה עם קולטן מתויג לצד גרסאות שאינן מסומנותבתווית 14.
גישת הכימות מטפלת בקשיים ספציפיים בפילוח ממברנות מדויק בנויטרופילים ב- vivo. בתאים של טבע אפיתל, כימות של רמות הקולטן יכול להתבצע באופן אוטומטי על ידי נרמול רמות קולטן הממברנה לסמן בקרה, אשר יכול לבוא לידי ביטוי יחד או בנפרד9. אכן, יישמנו גישה כזו, כאשר אנו משתמשים בבדיקת זיהוי ליגנד בעובריםגסטריים 14. עם זאת, נויטרופילים עוברים שינויים מורכבים ומהירים בצורת התא ב- vivo, מה שהופך את פילוח הממברנה לקשה הן בדו-ממד והן בתלת-ממד14. זה אפילו יותר מאתגר כאשר נויטרופילים אשכול, אשר מתרחשת בהגדרות פיזיולוגיות רבות29. מדד הניגודיות מתגבר על מגבלה זו מכיוון שהוא אינו דורש פילוח ממברנות אלא משקף את המצב הכולל של התפלגות הקולטן בתא (membranous/smooth vs vesicular/dotty). חשוב לציין כי מדד הניגודיות יכול להיות מושפע מהניגודיות הכוללת של התמונה, ולכן נדרשת נורמליזציה של ערכי תאים בודדים להפניה פנימית כדי להסביר את השונות של האות בעוברים/דגימות שונים. לדוגמה, השתמשנו בערך הניגודיות הממוצע לתאים של נויטרופילים שאינם מגיבים ב- CHT (כלומר, נויטרופילים שנשארים נייחים ואינם נודדים לסנפיר הגחון)14. אפשרות נוספת תהיה לנרמל עם ערכי ניגודיות של סמן בקרה באותו תא. זה יספק פתרון כאשר הפניה פנימית של תאים שאינם מגיבים אינה זמינה ועשויה לפתור הבדלים כמותיים עדינים יותר בדינמיקת הקולטן בין תנאים שונים.
מיקום ההדמיה הוא משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון. הסיבה לבחירת פצע הסנפיר הגחוני כאן, בניגוד לפצע סנפיר הזנב הנפוץ יותר מודל16,30, היא כי האתר של פציעה נמצא בקרבת האתר של מגורים נויטרופילים / מקור נודד. זה מאיץ את ציר הזמן של הבדיקה, כפי שלוקח יחסית מעט זמן עבור נויטרופילים להגיע. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות ללכוד את התנהגות התא הן במקור ההעברה (CHT) והן במיקום היעד של עניין (פצע). זה רלוונטי כאן, כי הרזולוציה המרחבית והזמן הנדרשת להדמיה תת-תאית קשה לשלב עם שדה ראייה גדול או סריקה מרובת מיקומים. לפיכך, בדיקת פצע הסנפיר הגחוני מאפשרת מעקב אחר התפתחות התגובה הנודדת ממקור הנדידה ולכידה סימולטנית של תנודות קולטן לא ספציפיות בתאים שאינם מגיבים. כפי שהוזכר לעיל, האחרון שימושי למטרות כימות כפי שהוא מספק התייחסות פנימית עבור דינמיקה לא ספציפית. במערכות אחרות, ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל התייחסות פנימית כזו, ובמקרה זה ערכי הניגודיות של סמן קרום מבוטא במשותף יספקו שליטה חלופית.
לסיכום, אנו צופים כי המתודולוגיה חלה על מערכות אחרות וניתן לפרוס אותה למגוון מטרות. לדוגמה, אותם כתבים יכולים להיות מנוצלים בהגדרות דלקתיות אחרות, כגון הגדרות זיהום או מודלים אחרים של מחלות. הרפרטואר של קווי הכתב קולטן דגי הזברה יכול להיות מורחב לקולטני איתות אחרים, כדי להבין מנגנוני איתות או לדווח על דינמיקה ליגנד ב vivo. הגישה יכולה להיות משולבת עם טכניקות נוקאאוט / נוקאאוט כדי לחקור את הבסיס המכני של דינמיקה נצפית. לדוגמה, הפרעה של ביטוי ליגנד יכול להצביע על התלות ligand עבור דינמיקה קולטן נצפתה. בעתיד, אנו צופים כי המערכת יכולה להיות מעודנת עוד יותר לשלב נוק-אין החדרה של כתבים. בסופו של דבר, ממצאים המשתמשים במתודולוגיה זו יספקו תובנות חדשניות בעלות ערך מעבר לקהילת דגי הזברה, בהתחשב בשימור קולטני האיתות האלה ביונקים ובאתגר היחסי של עריכת מחקרים אלה באורגניזמים גדולים יותר.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכריסטין הולט וביל האריס על העזרה במיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו מודים לדארן גילמור על מבני עמוד השדרה של הטיימר הפלואורסצנטי ואנה הוטנלוצ’ר על וקטור עמוד השדרה של טול 2-ליז. אנו מודים לסטיב רנשו על קו Tg (mpx:GFP)i114 . עבודה זו נתמכה על ידי MRC (MR/L019523/1), קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] ומענק אייזק ניוטון נאמנות 19.23(n). C.C נתמך על ידי סטודנטית MRC DTP ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק. H.W. נתמך על ידי סטודנטיות DTP MRC. H.P. נתמך על ידי מענק לדוקטורט של Wellcome Trust (105391/Z/Z/14/Z) ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/Z/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק MRC (MR/ L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |