ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における化学誘引受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析を実行するためのプロトコルについて説明します。
化学的勾配による白血球誘導は、免疫応答に不可欠である。好中球は、重要な抗菌機能を実行する組織損傷部位にリクルートされる最初の細胞です。これらの遺伝子座への彼らのトラフィッキングは、ケモカインを含むいくつかの炎症性化学誘引物質によって画策されている。分子レベルでは、化学誘引性シグナル伝達は、対応する受容体の細胞内輸送によって調節される。しかし、ケモカイン受容体の細胞内変化が細胞および組織レベルで白血球遊走ダイナミクスにどのように影響するかは不明のままである。ここでは、組織損傷に対する炎症反応中の好中球におけるケモカイン受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析のための方法論を説明する。これらのツールは、ゼブラフィッシュ好中球における示差的ケモカイン受容体トラフィッキングが、組織損傷部位における好中球クラスタリングおよび分散を調整することを明らかにした。これは、炎症反応がどのように自己解決されるかについての我々の理解に意味を持つ。記載されたツールは、様々な生理学的および病理学的設定における好中球移動パターンを理解するために使用でき、方法論は他のシグナル伝達受容体に拡張することができる。
白血球の移動は、免疫応答にとって最も重要である。免疫細胞は原型的な遊走細胞であり、組織や血管を横断し、微生物や他の重要な宿主細胞に向かって方向に移動するためのさまざまな化学的誘導の手がかりを感知する能力が非常に高い。正しいガイダンスは化学誘引物質の認識に依存しており、その中でケモカインは最も顕著なカテゴリー1を表す。ケモカインは、高度に特異的な7回膜貫通Gタンパク質共役型受容体によって認識される。ケモカイン結合すると、ケモカイン受容体は立体構造を変化させ、関連する三量体Gタンパク質の活性化および細胞骨格変化および指向性遊走を促進する機能的シグナル伝達サブユニットへのそれらの解離をもたらす1。第二に、ケモカイン受容体はリン酸化され、この修飾は誘引物質に対する脱感作をもたらし、その後、細胞表面からの急速な再感作/リサイクルまたは細胞内分解およびダウンレギュレーションが続くことができる2。これらの受容体ダイナミクスは、細胞が受けるシグナル伝達の持続時間および用量に影響を及ぼすが、それらが白血球遊走挙動にどのように影響するかを生体内で解明することは困難であった。
従来の哺乳類系における生きた白血球における受容体ダイナミクスの追跡は、いくつかの課題に直面している。ライブ研究では、蛍光タンパク質との受容体融合を細胞内で発現させなければならない。これは初代白血球、特に好中球において困難であり、これまでの研究では、ケモカイン受容体を発現するために代理好中球細胞株を使用してきた3,4。白血球が有益なトラフィッキング欠陥5,6を有する蛍光受容体または変異受容体を発現するトランスジェニックマウスモデルの作製には、かなりの時間と資源の投資が伴う。これらの例においても、生きた動物における受容体動態を画像化するための画像化分解能およびコントラストは制限される可能性があり、研究は固定組織切片5で免疫組織化学を用いている。これらの技術的課題を考えると、化学誘引性受容体のダイナミクスが生きた組織環境における細胞挙動にどのように影響するかについての我々の理解は、現在限られている。
ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における受容体トラフィッキングを監視するための方法論を提供する。ゼブラフィッシュはマウスと同様に遺伝的に扱いやすいが、効率的なトランスポゾン系と直接受精卵操作の使用により、トランスジェネシスは比較的簡単である7。透明な幼虫は理想的にはイメージングに適している。ケモカイン受容体ダイナミクスは、蛍光レポーター8、9、10との対応する融合体の発現によって始原生殖細胞および側線原基において視覚化されている。ゼブラフィッシュの幼虫は、哺乳類の好中球に関して高度に保存された遺伝的および細胞的特性を有する成熟した好中球を備えている。細胞骨格ダイナミクスおよび極性調節因子などの細胞内シグナル伝達ダイナミクスは、対応するトランスジェニック株11、12、13の生成によってこれらの細胞において視覚化されている。最近、我々は、組織損傷に対する炎症反応の過程で好中球におけるケモカイン受容体動態を可視化し、機能的に解析した14。ここでは、好中球におけるケモカインシグナル伝達のためのトランスジェニックレポーターラインの生成、ライブイメージングのための胚の調製、好中球シグナル伝達を研究するための創傷アッセイ、および画像の取得および分析のためのプロトコルについて説明する。また、候補リガンドに対するケモカイン受容体応答を試験するためのサイドプロトコルも提供しており、これは特徴付けられていない受容体におけるリガンド認識パターンを確立しようとする際に有用である。これらの技術は、内因性ケモカイン発現の阻害またはリガンド誘導性トラフィッキングの変化を伴う変異型受容体の生成などのさらなる遺伝子操作と組み合わせて使用して、特定のシグナル伝達ダイナミクスがインビボでの白血球挙動にどのように影響するかを調査することができる。蛍光標識されたケモカイン受容体を発現するトランスジェニック株は、直接抗体染色では検出が困難な内因性ケモカイン勾配のレポーターとしても使用することができる。記載された方法論は、レポーターの生成を他の免疫シグナル伝達受容体に拡大するための範囲を提供する。
記載された方法は、組織損傷に対する炎症反応の間にその場で内因性リガンドに応答した受容体動態のライブ画像化を可能にする。Cxcr1/Cxcr2好中球レポーターの使用は、感染、腫瘍モデルまたは他のタイプの組織損傷などの他の生理学的設定に拡大することができる14,25,26,27。さらに、内因性受容体が外因性変異受容体によって抑制およびレスキューされるトランスジェニックレスキューラインは、免疫応答における特定の好中球遊走パターンの重要性を解剖するための有用なツールを提供する可能性がある。例えば、脱感作障害を有するCxcr1受容体変異体は、炎症部位14においてより顕著な好中球クラスタリングを引き起こす。この機能表現型の獲得は、創傷修復、感染症、腫瘍の進化などのさまざまな生理学的プロセスにおける好中球会衆の役割を理解し、受容体ノックダウン/ノックアウト実験を補完するために使用することができる。この方法論はまた、利用可能なレポーターの範囲を拡大するための基礎を提供する。蛍光レポーターの選択は考慮することが重要であり、生物学的な問題に依存する。我々は、好中球におけるこれらのケモカイン受容体の構成代謝回転が上皮細胞と比較して高く、成熟の速いレポーター(例えば、sfGFP)が定常状態で膜レベルを報告し、好中球刺激時に差異を解決するために必要とされることを見出した8,14。したがって、sfGFP/tagRFPの膜比は、この細胞型におけるリガンド誘導インターナリゼーションの測定には適用できないが、tagRFPのパターンは受容体の細胞内運命の追跡を可能にし、いくつかの研究において有用であり得る。また、tagRFPの細胞内シグナルがより集中していることが、個々の幼虫のスクリーニングに有用であることも見出した。原形質膜における受容体レベルを測定するための代替アプローチは、同じ導入遺伝子9または独立した導入遺伝子14のいずれかにおいて好中球において蛍光膜マーカーを共発現させることであろう。前者のシナリオでは、導入遺伝子は魚をスクリーニングするための追加の手段を提供し、発現レベルはマーカーと受容体の間で同等であろう。後者のアプローチは、受容体レポーターを有するゼブラフィッシュ系統を異なるレポーター系統と組み合わせることができるという点で、よりモジュール化されるであろう。いずれの場合も、受容体レベルの膜定量化がクラスター化好中球において困難であることは注目に値します(下記参照)。最後に、このプロトコルの拡張の可能性は、より詳細な局在化分析のために免疫組織化学によるライブイメージングをフォローアップすることであることに留意する。
Tol2トランスジェネシス系は十分に確立されており7 、リゾチームCプロモーターは好中球発現11、15に広く使用されている。したがって、トランスジェネシスアプローチは比較的単純であり、このプロモーターで達成される発現レベルは、受容体ダイナミクスの分析に十分なコントラストを提供するのに十分高い。可能な制限は、発現レベルが内因性受容体発現レベルを反復しないことである。新しいCRISPR技術を導入して、特に関心のある受容体に対するノックインラインを確立することができる28。これらの技術はまだ煩雑であり、細胞内イメージングに必要な発現レベルを保証するものではないかもしれないが、それらの成功した開発は、内因性シグナル伝達ダイナミクスを理解するための重要なブレークスルーとなるであろう。機能検証は、トランスジェニック受容体構築物を用いてデータを解釈するために重要である。例えば、リガンド認識アッセイを使用して、蛍光融合タンパク質が機能的であることを立証することができ、ノックアウト表現型のレスキューを使用して、トランスジェニック好中球発現レベルが機能性14と適合性であることを立証することができる。最後に、受容体融合を検証するより直接的な方法は、標識受容体を非標識バージョン14とともに有するin vitro機能アッセイを利用することである。
定量化アプローチは、インビボでの好中球における正確な膜セグメンテーションにおける特定の困難に対処する。上皮性の細胞では、膜受容体レベルを制御マーカーに正規化することによって受容体レベルの定量を自動的に実行することができ、これはタンデムまたは別々に発現させることができる9。実際、我々は、このようなアプローチを、胃胚14においてリガンド認識アッセイを使用する場合に適用した。しかし、好中球はインビボで細胞形状の複雑で急速な変化を受け、2Dおよび3D14の両方で膜セグメンテーションを困難にする。これは、好中球がクラスター化するとさらに困難であり、これは多くの生理学的設定で起こる29。コントラスト測定は、膜セグメンテーションを必要とせず、代わりに細胞内の受容体分布の全体的な状態(膜状/滑らか対小胞性/点状)を反映するため、この制限を克服します。コントラストメトリックは画像の全体的なコントラストの影響を受ける可能性があるため、異なる胚/サンプルにおけるシグナルの変動性を考慮するには、個々の細胞値を内部参照に正規化する必要があることに注意することが重要です。例えば、CHT中の非応答性好中球(すなわち、静止したままで腹側フィンに移行しない好中球)の平均細胞コントラスト値を使用した14。追加の可能性は、同じセル内の対照マーカーのコントラスト値で正規化することです。これは、非応答細胞の内部参照が利用できない場合に解決策を提供し、異なる条件間の受容体ダイナミクスのより細かい定量的差異を解決する可能性がある。
イメージングの位置は、考慮すべきもう 1 つの変数です。ここで腹鰭創傷を選択する理由は、より一般的に使用される尾びれ創傷モデル16,30とは対照的に、創傷部位が好中球居住/遊走起源の部位の近くにあるためである。これにより、好中球が到着するのに比較的短い時間がかかるため、アッセイのタイムラインが加速されます。さらに、遊走起点(CHT)と標的の関心位置(創傷)の両方で細胞の挙動をキャプチャする機会を提供します。これは、細胞内イメージングに必要な空間的および時間的分解能が、大きな視野またはマルチポジションスキャンと組み合わせることが困難であるため、ここで関連しています。したがって、腹側ひれ創傷アッセイは、遊走起源からの遊走応答の進化の追跡および応答しない細胞における非特異的受容体変動の同時捕捉を可能にする。前述のように、後者は、不特定のダイナミクスの内部基準を提供するため、定量化の目的に有用である。他の系では、そのような内部基準を有することができない場合があり、その場合、共発現膜マーカーのコントラスト値は、代替制御を提供するであろう。
要約すると、この方法論は他のシステムにも適用可能であり、さまざまな目的に展開できると期待しています。例えば、同じレポーターを、感染設定または他の疾患モデルなどの他の炎症性設定において利用することができる。ゼブラフィッシュ受容体レポーターラインのレパートリーは、他のシグナル伝達受容体に拡張して、シグナル伝達機構を理解したり、インビボでのリガンドダイナミクスを報告したりすることができる。このアプローチをノックダウン/ノックアウト技術と組み合わせて、観測されたダイナミクスの機構的基礎を調査することができます。例えば、リガンド発現の摂動は、観察された受容体ダイナミクスに対するリガンド依存性を示すことができる。将来的には、レポーターのノックイン挿入を取り入れるために、システムをさらに洗練させることができると想定しています。究極的には、この方法論を用いた知見は、哺乳類におけるこれらのシグナル伝達受容体の保存と、より大きな生物でこれらの研究を実施することの相対的な課題を考えると、ゼブラフィッシュコミュニティを超えて価値のある新しい洞察を提供するであろう。
The authors have nothing to disclose.
共焦点顕微鏡の協力をしてくれたクリスティーン・ホルトとビル・ハリスに感謝します。蛍光タイマーバックボーン構築物のDarren GilmourとTol2-LyzバックボーンベクトルのAnna Huttenlocherに感謝します。Steve Renshaw さんの Tg(mpx:GFP)i114 ラインに感謝します。この作業はMRC(MR/L019523/1)、ウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト[12.21(a)i]とアイザック・ニュートン・トラストは19.23(n)を認可します。C.C.はMRC DTPの学生として、また一部はWellcome Trust [204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金H.W.はMRC DTPスチューデントシップによって支援されました。H.P.はウェルカム・トラストの博士号助成金(105391/Z/14/Z)とウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]の支援を受けた。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金と MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |