Nous décrivons ici les protocoles permettant d’effectuer une imagerie en direct et une analyse quantitative de la dynamique des récepteurs chimioattractifs chez les neutrophiles du poisson-zèbre
Le guidage des leucocytes par gradients chimiques est essentiel pour les réponses immunitaires. Les neutrophiles sont les premières cellules à être recrutées sur des sites de lésions tissulaires où elles exécutent des fonctions antimicrobiennes cruciales. Leur trafic vers ces loci est orchestré par plusieurs chimioattractants inflammatoires, dont des chimiokines. Au niveau moléculaire, la signalisation chimioattractante est régulée par le trafic intracellulaire des récepteurs correspondants. Cependant, on ne sait toujours pas comment les changements subcellulaires dans les récepteurs de la chimiokine affectent la dynamique de la migration des leucocytes au niveau des cellules et des tissus. Nous décrivons ici une méthodologie pour l’imagerie en direct et l’analyse quantitative de la dynamique des récepteurs de la chimiokine dans les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires. Ces outils ont révélé que le trafic différentiel des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles du poisson-zèbre coordonne le regroupement et la dispersion des neutrophiles sur les sites de lésions tissulaires. Cela a des implications pour notre compréhension de la façon dont les réponses inflammatoires sont auto-résolues. Les outils décrits pourraient être utilisés pour comprendre les schémas de migration des neutrophiles dans une variété de contextes physiologiques et pathologiques et la méthodologie pourrait être étendue à d’autres récepteurs de signalisation.
La migration des leucocytes est d’une importance capitale pour les réponses immunitaires. Les cellules immunitaires sont des cellules migratrices prototypiques, qui sont remarquablement capables de traverser les tissus et les vaisseaux sanguins et de détecter une gamme de signaux de guidage chimique pour migrer de manière directionnelle vers les microbes ou d’autres cellules hôtes importantes. Des directives correctes reposent sur la reconnaissance des chimioattractifs, parmi lesquels les chimiokines représentent la catégorie1 la plus importante. Les chimiokines sont reconnues par des récepteurs couplés à la protéine G à sept transmembranes très spécifiques. Lors de la liaison à la chimiokine, les récepteurs de la chimiokine changent de conformation conduisant à l’activation des protéines G trimériques associées et à leur dissociation en sous-unités de signalisation fonctionnelles qui favorisent les changements cytosquelettiques et la migration dirigée1. Secondairement, les récepteurs de la chimiokine sont phosphorylés, et cette modification conduit à une désensibilisation à l’attractif, qui peut être suivie d’une re-sensibilisation / recyclage rapide ou d’une dégradation intracellulaire et d’une régulation négative de la surface cellulaire2. Ces dynamiques de récepteurs influencent la durée et la dose de signalisation reçues par les cellules, mais la façon dont elles affectent le comportement de migration des leucocytes a été difficile à élucider in vivo.
Le suivi de la dynamique des récepteurs dans les leucocytes vivants dans les systèmes traditionnels des mammifères fait face à plusieurs défis. Pour les études vivantes, les fusions de récepteurs avec des protéines fluorescentes doivent être exprimées dans les cellules. Ceci est difficile dans les leucocytes primaires, en particulier dans les neutrophiles, et des études ont jusqu’à présent utilisé des lignées cellulaires de neutrophiles de substitution pour exprimer les récepteursde chimiokine 3,4. La génération de modèles murins transgéniques, dans lesquels les leucocytes expriment un récepteur fluorescent ou des récepteurs mutants présentant des défauts de trafic informatifs 5,6, implique un investissement considérable en temps et en ressources. Même dans ces cas, la résolution d’imagerie et le contraste pour la dynamique des récepteurs d’imagerie chez l’animal vivant peuvent être limités et des études ont utilisé l’immunohistochimie sur des sections de tissus fixes5. Compte tenu de ces défis techniques, notre compréhension de la façon dont la dynamique des récepteurs chimioattractifs affecte le comportement cellulaire dans un environnement tissulaire vivant est actuellement limitée.
Nous fournissons ici une méthodologie pour surveiller le trafic de récepteurs dans les neutrophiles du poisson-zèbre. Les poissons-zèbres sont génétiquement traitables, comme les souris, mais la transgénèse est relativement plus simple grâce à l’utilisation de systèmes de transposon efficaces et à la manipulation directe des zygotes7. La larve transparente se prête idéalement à l’imagerie. La dynamique des récepteurs de la chimiokine a été visualisée dans les cellules germinales primordiales et la ligne latérale primordium par l’expression de fusions correspondantes avec des rapporteurs fluorescents 8,9,10. Les larves de poisson zèbre sont équipées de neutrophiles matures qui ont des propriétés génétiques et cellulaires hautement conservées par rapport aux neutrophiles de mammifères. La dynamique de signalisation subcellulaire telle que la dynamique du cytosquelette et les régulateurs de polarité ont été visualisées dans ces cellules par la génération de lignées transgéniques correspondantes 11,12,13. Récemment, nous avons visualisé et analysé fonctionnellement la dynamique des récepteurs de la chimiokine chez les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires14. Ici, nous décrivons la génération de lignes rapporteures transgéniques pour la signalisation des chimiokines dans les neutrophiles, la préparation d’embryons pour l’imagerie vivante, un test de plaie pour l’étude de la signalisation des neutrophiles et le protocole d’acquisition et d’analyse d’images. Nous fournissons également un protocole parallèle pour tester les réponses des récepteurs de chimiokine aux ligands candidats, ce qui est utile pour essayer d’établir des modèles de reconnaissance de ligand dans des récepteurs non caractérisés. Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec d’autres manipulations génétiques, telles que l’inhibition de l’expression endogène de la chimiokine ou la génération de récepteurs mutants avec un trafic altéré induit par un ligand, pour interroger comment la dynamique de signalisation spécifique affecte le comportement des leucocytes in vivo. Les lignées transgéniques exprimant des récepteurs de chimiokine marqués par fluorescence peuvent également être utilisées comme rapporteurs pour les gradients endogènes de chimiokine, qui sont autrement difficiles à détecter par coloration directe des anticorps. La méthodologie décrite permet d’étendre la génération de rapporteurs à d’autres récepteurs d’immuno-signalisation.
La méthode décrite permet l’imagerie en direct de la dynamique des récepteurs en réponse à des ligands endogènes in situ lors d’une réponse inflammatoire à des lésions tissulaires. L’utilisation de rapporteurs de neutrophiles Cxcr1/Cxcr2 pourrait être étendue à d’autres contextes physiologiques, tels que les infections, les modèles tumoraux ou d’autres types de lésions tissulaires 14,25,26,27. En outre, les lignes de sauvetage transgéniques, dans lesquelles le récepteur endogène est supprimé et sauvé par un récepteur mutant exogène, pourraient fournir des outils utiles pour disséquer l’importance de schémas de migration de neutrophiles spécifiques dans les réponses immunitaires. Par exemple, les mutants du récepteur Cxcr1 qui ont une désensibilisation altérée provoquent un regroupement plus important des neutrophiles aux sites inflammatoires14. Ce gain de phénotype fonctionnel pourrait être utilisé pour comprendre le rôle de la congrégation des neutrophiles dans différents processus physiologiques, par exemple la réparation des plaies, les maladies infectieuses ou l’évolution tumorale, et compléter les expériences de destruction / élimination des récepteurs. La méthodologie fournit également une base pour élargir l’éventail des déclarants disponibles. Le choix du rapporteur fluorescent est important à considérer et dépend de la question biologique. Nous avons constaté que le renouvellement constitutif de ces récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles était élevé, par rapport aux cellules épithéliales, et que les rapporteurs à maturation rapide (par exemple, sfGFP) étaient tenus de signaler les niveaux membranaires à l’état d’équilibre et de résoudre les différences lors de la stimulation des neutrophiles 8,14. Ainsi, les rapports membranaires de sfGFP/tagRFP ne sont pas applicables pour mesurer l’internalisation induite par les ligands dans ce type de cellule, mais le modèle de tagRFP permet de suivre le destin intracellulaire du récepteur, ce qui pourrait être utile dans certaines études. Nous avons également constaté que le signal intracellulaire plus concentré de tagRFP est utile pour le dépistage des larves individuelles. Une autre approche pour mesurer les niveaux de récepteurs au niveau de la membrane plasmique consisterait à co-exprimer un marqueur de membrane fluorescente dans les neutrophiles soit dans le même transgène9, soit dans un transgèneindépendant 14. Dans le premier scénario, le transgène fournirait un moyen supplémentaire de criblage des poissons et les niveaux d’expression seraient comparables entre le marqueur et le récepteur. Cette dernière approche serait plus modulaire, en ce sens qu’une ligne de poisson-zèbre avec un rapporteur de récepteur pourrait être combinée avec différentes lignes de rapporteur. Dans les deux cas, il convient de noter que la quantification membranaire des niveaux de récepteurs est difficile chez les neutrophiles groupés (voir ci-dessous). Enfin, nous notons qu’une extension possible de ce protocole serait de suivre l’imagerie en direct par immunohistochimie pour des analyses de localisation plus détaillées.
Le système de transgénèse Tol2 est bien établi7 et le promoteur du lysozyme C a été largement utilisé pour l’expression des neutrophiles11,15. L’approche de la transgénèse est donc relativement simple et le niveau d’expression atteint avec ce promoteur est suffisamment élevé pour fournir un contraste suffisant pour l’analyse de la dynamique des récepteurs. Une limitation possible est que le niveau d’expression ne récapitule pas les niveaux d’expression des récepteurs endogènes. De nouvelles technologies CRISPR pourraient être déployées pour établir des lignes d’inction pour les récepteurs présentant un intérêt particulier28. Ces technologies sont encore lourdes et ne garantissent peut-être pas les niveaux d’expression requis pour l’imagerie subcellulaire, mais leur développement réussi serait une percée importante pour la compréhension de la dynamique de signalisation endogène. Les validations fonctionnelles sont importantes pour interpréter les données avec des constructions de récepteurs transgéniques. Par exemple, les tests de reconnaissance de ligand peuvent être utilisés pour établir que la protéine de fusion fluorescente est fonctionnelle et le sauvetage des phénotypes knockout pourrait être utilisé pour établir que les niveaux d’expression des neutrophiles transgéniques sont compatibles avec la fonctionnalité14. Enfin, un moyen plus direct de valider la fusion des récepteurs serait d’utiliser un test fonctionnel in vitro avec un récepteur marqué aux côtés des versions non marquées14.
L’approche de quantification aborde des difficultés spécifiques dans la segmentation précise de la membrane chez les neutrophiles in vivo. Dans les cellules de nature épithéliale, la quantification des niveaux de récepteurs peut être effectuée automatiquement en normalisant les niveaux de récepteurs membranaires en un marqueur de contrôle, qui peut être exprimé en tandem ou séparément9. En effet, nous avons appliqué une telle approche, lors de l’utilisation du test de reconnaissance de ligand dans des embryons gastrulés14. Cependant, les neutrophiles subissent des changements complexes et rapides dans la forme cellulaire in vivo, ce qui rend la segmentation membranaire difficile à la fois en 2D et en 3D14. Ceci est encore plus difficile lorsque les neutrophiles se regroupent, ce qui se produit dans de nombreux contextes physiologiques29. La mesure de contraste surmonte cette limitation car elle ne nécessite pas de segmentation membranaire mais reflète plutôt l’état global de la distribution des récepteurs dans la cellule (membraneuse / lisse vs vésiculeuse / pointilleuse). Il est important de noter que la mesure du contraste peut être affectée par le contraste global de l’image, de sorte que la normalisation des valeurs cellulaires individuelles à une référence interne est nécessaire pour tenir compte de la variabilité du signal dans différents embryons / échantillons. Par exemple, nous avons utilisé la valeur moyenne de contraste cellulaire des neutrophiles non réactifs dans le CHT (c.-à-d. les neutrophiles qui restent stationnaires et ne migrent pas dans la nageoire ventrale)14. Une possibilité supplémentaire serait de normaliser avec les valeurs de contraste d’un marqueur de contrôle dans la même cellule. Cela fournirait une solution lorsqu’une référence interne de cellules non répondantes n’est pas disponible et pourrait probablement résoudre des différences quantitatives plus fines dans la dynamique des récepteurs entre différentes conditions.
L’emplacement de l’imagerie est une autre variable à considérer. La raison du choix de la plaie de la nageoire ventrale ici, par opposition au modèle16,30 de la plaie de la nageoire caudale plus couramment utilisé, est que le site de la blessure est à proximité du site de résidence des neutrophiles / origine migratoire. Cela accélère la chronologie du test, car il faut relativement peu de temps pour que les neutrophiles arrivent. En outre, il offre la possibilité de capturer le comportement des cellules à la fois à l’origine de la migration (CHT) et à l’emplacement cible d’intérêt (plaie). Ceci est pertinent ici, car la résolution spatiale et temporelle requise pour l’imagerie subcellulaire est difficile à combiner avec un grand champ de vision ou un balayage multi-positions. Ainsi, le test de la plaie de la nageoire ventrale permet de suivre l’évolution de la réponse migratoire à partir de l’origine de la migration et de capturer simultanément les fluctuations non spécifiques des récepteurs dans les cellules qui ne répondent pas. Comme mentionné ci-dessus, ce dernier est utile à des fins de quantification car il fournit une référence interne pour les dynamiques non spécifiques. Dans d’autres systèmes, il peut ne pas être possible d’avoir une telle référence interne, auquel cas les valeurs de contraste d’un marqueur membranaire co-exprimé fourniraient un autre contrôle.
En résumé, nous prévoyons que la méthodologie est applicable à d’autres systèmes et peut être déployée à diverses fins. Par exemple, les mêmes rapporteurs pourraient être utilisés dans d’autres contextes inflammatoires, tels que les contextes d’infection ou d’autres modèles de maladie. Le répertoire des lignes rapporteures des récepteurs du poisson-zèbre pourrait être étendu à d’autres récepteurs de signalisation, afin de comprendre les mécanismes de signalisation ou de rapporter la dynamique des ligands in vivo. L’approche peut être combinée avec des techniques knockdown/knockout pour interroger la base mécaniste de la dynamique observée. Par exemple, la perturbation de l’expression du ligand peut indiquer la dépendance du ligand pour la dynamique des récepteurs observée. À l’avenir, nous envisageons que le système pourrait être encore affiné pour intégrer l’insertion directe de journalistes. En fin de compte, les résultats utilisant cette méthodologie fourniraient de nouvelles informations précieuses au-delà de la communauté des poissons-zèbres, compte tenu de la conservation de ces récepteurs de signalisation chez les mammifères et du défi relatif de mener ces études dans des organismes plus grands.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Christine Holt et Bill Harris pour leur aide en microscopie confocale. Nous remercions Darren Gilmour pour les constructions de l’épine dorsale de la minuterie fluorescente et Anna Huttenlocher pour le vecteur de l’épine dorsale Tol2-Lyz. Nous remercions Steve Renshaw pour la ligne Tg(mpx:GFP)i114 . Ce travail a été soutenu par le MRC (MR/L019523/1), le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et une subvention Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. a été soutenu par une bourse d’études mrc DTP et en partie par le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvention. H.W. a été soutenu par une bourse d’études mrc pao. H.P. a été soutenu par une bourse de doctorat Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) et en partie par un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et la MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |