여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.
화학적 구배에 의한 백혈구 안내는 면역 반응에 필수적입니다. 호중구는 중요한 항균 기능을 수행하는 조직 손상 부위에 모집 된 최초의 세포입니다. 이 유전자좌로의 밀매는 케모카인을 포함한 여러 염증성 화학 유인제에 의해 조정됩니다. 분자 수준에서, 화학유인제 신호전달은 상응하는 수용체의 세포내 밀매에 의해 조절된다. 그러나 케모카인 수용체의 세포 내 변화가 세포 및 조직 수준에서 백혈구 이동 역학에 어떻게 영향을 미치는지는 분명하지 않습니다. 여기서 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량 분석을위한 방법론을 설명합니다. 이러한 도구는 제브라피쉬 호중구에서의 차등 케모카인 수용체 밀매가 조직 손상 부위에서 호중구 군집화 및 분산을 조정한다는 것을 밝혀냈다. 이것은 염증 반응이 어떻게 스스로 해결되는지에 대한 우리의 이해에 영향을 미칩니다. 기술된 도구들은 다양한 생리학적 및 병리학적 설정들에서 호중구 이동 패턴을 이해하는데 사용될 수 있고, 방법론은 다른 신호전달 수용체들로 확장될 수 있다.
백혈구 이동은 면역 반응에 가장 중요합니다. 면역 세포는 원형 철새 세포로, 조직과 혈관을 횡단하고 미생물 또는 기타 중요한 숙주 세포쪽으로 방향으로 이동하기위한 다양한 화학적 안내 신호를 감지 할 수 있습니다. 올바른 지침은 화학 유인 물질의 인식에 의존하며, 그 중 케모카인은 가장 두드러진 범주1을 나타냅니다. 케모카인은 고도로 특이적인 일곱 막횡단 G 단백질 결합 수용체에 의해 인식된다. 케모카인 결합시, 케모카인 수용체는 형태 변화를 일으켜 연관된 삼량체 G 단백질의 활성화와 세포골격 변화 및 지시된 이동을 촉진하는 기능적 신호전달 서브유닛으로의 해리를 유도한다1. 이차적으로, 케모카인 수용체는 인산화되고, 이러한 변형은 유인제에 대한 탈감작으로 이어지고, 이는 신속한 재감작/재활용 또는 세포내 분해 및 세포 표면으로부터의 하향 조절(down-regulation 2)에 뒤따를 수 있다. 이러한 수용체 역학은 세포에 의해 수신되는 신호전달의 지속 기간 및 용량에 영향을 미치지만, 이들이 백혈구 이동 거동에 어떻게 영향을 미치는지 생체내에서 밝히기가 어려웠다.
전통적인 포유류 시스템에서 살아있는 백혈구에서 수용체 역학을 추적하는 것은 몇 가지 도전에 직면 해 있습니다. 살아있는 연구를 위해, 형광 단백질과의 수용체 융합은 세포에서 발현되어야 한다. 이것은 원발성 백혈구, 특히 호중구에서 도전적이며, 지금까지의 연구는 케모카인 수용체 3,4를 발현하기 위해 대리 호중구 세포주를 사용했다. 백혈구가 유익한 인신 매매 결함 5,6을 갖는 형광 수용체 또는 돌연변이 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델의 생성은 상당한 시간과 자원의 투자를 수반한다. 이러한 경우에도, 살아있는 동물에서 수용체 역학을 영상화하기 위한 이미징 해상도 및 콘트라스트는 제한될 수 있고, 연구는 고정된 조직 절편(5)에 대한 면역조직화학을 이용하였다. 이러한 기술적 과제를 감안할 때, 화학 유인 수용체 역학이 살아있는 조직 환경에서 세포 거동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해는 현재 제한적입니다.
여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 수용체 밀매를 모니터링하는 방법론을 제공합니다. 제브라피쉬는 생쥐처럼 유전적으로 다루기 쉽지만, 효율적인 트랜스포존 시스템과 직접 접합체 조작을 통해 트랜스제네시스가 비교적 더 간단하다7. 투명한 유충은 이상적으로 이미징에 복종 할 수 있습니다. 케모카인 수용체 역학은 형광 리포터 8,9,10과의 상응하는 융합체의 발현에 의해 원시성 생식 세포 및 측선 프리모듐에서 시각화되었다. Zebrafish 유충은 포유류 호중구와 관련하여 유전 적 및 세포 특성을 고도로 보존 한 성숙한 호중구를 갖추고 있습니다. 세포골격 역학 및 극성 조절제와 같은 세포하 신호전달 역학은 상응하는 트랜스제닉 라인(11,12,13)의 생성에 의해 이들 세포에서 시각화되었다. 최근에, 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응의 과정 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학을 시각화하고 기능적으로 분석하였다14. 여기에서는 호중구에서 케모카인 신호전달을 위한 형질전환 리포터 라인의 생성, 라이브 이미징을 위한 배아의 준비, 호중구 신호전달을 연구하기 위한 상처 분석 및 이미지의 획득 및 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 또한 후보 리간드에 대한 케모카인 수용체 반응을 시험하기 위한 사이드 프로토콜을 제공하며, 이는 특징이 없는 수용체에서 리간드 인식 패턴을 확립하려고 할 때 유용하다. 이들 기술은 내인성 케모카인 발현의 억제 또는 변경된 리간드-유도된 인신매매를 갖는 돌연변이 수용체의 생성과 같은 추가의 유전자 조작과 조합하여, 특정 신호전달 역학이 생체내에서 백혈구 거동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 사용될 수 있다. 형광 태깅된 케모카인 수용체를 발현하는 트랜스제닉 라인은 또한 내인성 케모카인 구배에 대한 리포터로서 사용될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 직접 항체 염색에 의해 검출하기 어렵다. 기술된 방법론은 리포터의 생성을 다른 면역-신호전달 수용체로 확장시키기 위한 범위를 제공한다.
기술된 방법은 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 계내에서 내인성 리간드에 반응하는 수용체 역학의 살아있는 이미징을 허용한다. Cxcr1/Cxcr2 호 중구 리포터의 사용은 감염, 종양 모델 또는 다른 유형의 조직 손상(14,25,26,27)과 같은 다른 생리학적 설정으로 확장될 수 있다. 또한, 내인성 수용체가 외인성 돌연변이 수용체에 의해 억제되고 구출되는 트랜스제닉 구조 라인은 면역 반응에서 특정 호중구 이동 패턴의 중요성을 해부하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탈감작 장애를 갖는 Cxcr1 수용체 돌연변이체는 염증 부위(14)에서 더욱 두드러진 호중구 클러스터링을 야기한다. 이러한 기능 표현형의 이득은 상이한 생리학적 과정들, 예를 들어, 상처 복구, 감염성 질환 또는 종양 진화, 및 보체 수용체 녹다운/녹아웃 실험에서 호중구 회중의 역할을 이해하는데 사용될 수 있다. 이 방법론은 또한 사용 가능한 기자의 범위를 확대 할 수있는 기반을 제공합니다. 형광 리포터의 선택은 고려해야 할 중요한 것이며 생물학적 질문에 달려 있습니다. 우리는 호중구에서 이러한 케모카인 수용체의 구성 회전율이 상피 세포와 비교하여 높았으며 빠른 성숙 (예 : sfGFP)을 가진 기자가 정상 상태에서 막 수준을보고하고 호중구 자극시 차이를 해결해야한다는 것을 발견했습니다 8,14. 따라서, sfGFP/tagRFP의 막 비율은 이 세포 유형에서 리간드-유도된 내재화를 측정하는 데는 적용되지 않지만, tagRFP의 패턴은 수용체의 세포내 운명의 추적을 허용하며, 이는 일부 연구에서 유용할 수 있다. 우리는 또한 tagRFP의 더 집중된 세포 내 신호가 개별 유충을 스크리닝하는 데 유용하다는 것을 발견했습니다. 원형질막에서 수용체 수준을 측정하기 위한 대안적인 접근법은 동일한 전이유전자(9) 또는 독립적인 전이유전자(14)에서 호중구에서 형광막 마커를 공동발현시키는 것이다. 이전의 시나리오에서, 전이유전자는 물고기를 스크리닝하기 위한 추가적인 수단을 제공할 것이고, 발현 수준은 마커와 수용체 사이에서 필적할 것이다. 후자의 접근법은 수용체 리포터가있는 제브라 피쉬 라인이 다른 리포터 라인과 결합 될 수 있다는 점에서 더 모듈화 될 것입니다. 두 경우 모두 수용체 수준의 막 정량화가 군집형 호중구에서 어렵다는 점은 주목할 가치가 있습니다 (아래 참조). 마지막으로, 우리는이 프로토콜의 가능한 확장은보다 상세한 국소화 분석을 위해 면역 조직 화학에 의한 라이브 이미징을 후속 조치하는 것입니다.
Tol2 형질생성 시스템은 잘 확립되어 있고7 라이소자임 C 프로모터는 호중구 발현11,15를 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서, 트랜스제네시스 접근법은, 비교적 간단하고, 이러한 프로모터로 달성된 발현 수준은 수용체 역학의 분석을 위한 충분한 콘트라스트를 제공하기에 충분히 높다. 가능한 제한은 발현 수준이 내인성 수용체 발현 수준을 재구하지 않는다는 것이다. 새로운 CRISPR 기술은 특정 관심의 수용체에 대한 녹인 라인을 확립하기 위해 배치될 수 있다(28). 이러한 기술은 여전히 번거롭고 세포 내 이미징에 필요한 발현 수준을 보장하지는 않지만 성공적인 개발은 내인성 신호 역학을 이해하는 데 중요한 돌파구가 될 것입니다. 기능적 검증은 트랜스제닉 수용체 구축물을 사용한 데이터를 해석하는데 중요하다. 예를 들어, 리간드 인식 분석은 형광 융합 단백질이 기능적이라는 것을 확립하는데 사용될 수 있고, 넉아웃 표현형을 구하고, 트랜스제닉 호중구 발현 수준이 기능성14와 양립가능하다는 것을 확립하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 수용체 융합을 검증하는 보다 직접적인 방법은 표지되지 않은 버전14와 함께 표지된 수용체를 갖는 시험관내 기능적 검정을 이용하는 것이다.
정량화 접근법은 생체 내에서 호중구에서 정확한 막 세분화의 특정 어려움을 해결합니다. 상피 성질의 세포에서, 수용체 수준의 정량화는 막 수용체 수준을 조절 마커로 정상화함으로써 자동으로 실행될 수 있으며, 이는 병렬로 또는 개별적으로 발현될 수 있다9. 실제로, 우리는 가스트레이션 배아14에서 리간드-인식 검정을 사용할 때 그러한 접근법을 적용하였다. 그러나 호중구는 생체 내에서 세포 모양의 복잡하고 급격한 변화를 겪어 2D 및 3D14에서 막 세분화를 어렵게 만듭니다. 이것은 호중구 군집이 많은 생리적 환경29에서 발생하는 경우 훨씬 더 도전적입니다. 대조 메트릭은 막 세분화를 필요로하지 않고 대신 세포에서 수용체 분포의 전체 상태 (막성 / 부드러운 대 수포 / 도티)를 반영하기 때문에이 제한을 극복합니다. 콘트라스트 메트릭은 이미지의 전체 대비에 의해 영향을 받을 수 있으므로 서로 다른 배아/샘플에서 신호의 변동성을 설명하기 위해서는 개별 세포 값을 내부 참조로 정규화해야 합니다. 예를 들어, 우리는 CHT에서 반응하지 않는 호중구의 평균 세포 대조 값 (즉, 정지되어 있고 복부 지느러미로 이동하지 않는 호중구)14를 사용했습니다. 추가적인 가능성은 동일한 세포에서 대조 마커의 대조 값으로 정규화하는 것이다. 이것은 무반응 세포의 내부 참조가 이용 가능하지 않을 때 해결책을 제공 할 것이고, 다른 조건 사이의 수용체 역학의 미세한 정량적 차이를 해결할 수 있습니다.
이미징의 위치는 고려해야 할 또 다른 변수입니다. 더 일반적으로 사용되는 꼬리 지느러미 상처 모델16,30과는 달리 복부 지느러미 상처를 여기에서 선택하는 이유는 상처 부위가 호중구 거주지 / 철새 기원 부위 근처에 있기 때문입니다. 이것은 호중구가 도착하는 데 상대적으로 적은 시간이 걸리기 때문에 분석의 타임 라인을 가속화합니다. 추가적으로, 그것은 이동 기원 (CHT) 및 관심의 표적 위치 (상처) 둘 다에서 세포 거동을 포착할 수 있는 기회를 제공한다. 이는 세포하 영상화에 필요한 공간적 및 시간적 분해능이 넓은 시야각 또는 다중 위치 스캐닝과 결합하기 어렵기 때문에 여기에서 관련이 있다. 따라서, 복부 지느러미 상처 분석은 이동 기원으로부터의 이주 반응의 진화를 추적하고 반응하지 않는 세포에서 비특이적 수용체 변동을 동시에 포착하는 것을 허용한다. 위에서 언급했듯이, 후자는 불특정 역학에 대한 내부 참조를 제공하기 때문에 정량화 목적으로 유용합니다. 다른 시스템에서, 이러한 내부 참조를 갖는 것이 불가능할 수 있으며, 이 경우 공동-발현된 막 마커의 콘트라스트 값은 대안적인 제어를 제공할 것이다.
요약하면, 우리는 방법론이 다른 시스템에 적용 가능하고 다양한 목적으로 배포 될 수 있다고 예상합니다. 예를 들어, 동일한 리포터가 감염 설정 또는 다른 질병 모델과 같은 다른 염증 설정에서 활용될 수 있다. 제브라피쉬 수용체 리포터 라인의 레퍼토리는 다른 신호전달 수용체로 확장될 수 있고, 신호전달 메카니즘을 이해하거나 생체내에서 리간드 역학을 보고할 수 있다. 이 접근법은 녹다운/녹아웃 기술과 결합하여 관찰된 역학의 기계론적 기초를 조사할 수 있다. 예를 들어, 리간드 발현의 섭동은 관찰된 수용체 역학에 대한 리간드 의존성을 나타낼 수 있다. 앞으로는 기자의 녹인 삽입을 통합하기 위해 시스템을 더욱 정교하게 만들 수 있을 것으로 예상합니다. 궁극적으로,이 방법론을 사용한 발견은 포유류에서 이러한 신호 수용체의 보존과 더 큰 유기체에서 이러한 연구를 수행하는 상대적 도전을 감안할 때 제브라 피쉬 공동체를 넘어서는 가치있는 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 공초점 현미경 검사에 도움을 주신 Christine Holt와 Bill Harris에게 감사드립니다. 형광 타이머 백본 구축물에 대한 대런 길모어와 Tol2-Lyz 백본 벡터에 대한 Anna Huttenlocher에게 감사드립니다. Tg(mpx:GFP)i114 라인에 대해 Steve Renshaw에게 감사드립니다. 이 작업은 MRC (MR / L019523 / 1), Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i]와 아이작 뉴턴 트러스트 보조금 19.23 (n). C.C.는 MRC DTP 학생회와 Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금. H.W.는 MRC DTP Studentship의 지원을 받았습니다. H.P.는 Wellcome Trust PhD 보조금 (105391 / Z / 14 / Z)과 Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금과 MRC (MR / L019523 / 1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |