Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij zebravisneufielen
Leukocytengeleiding door chemische gradiënten is essentieel voor immuunresponsen. Neutrofielen zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op plaatsen van weefselbeschadiging waar ze cruciale antimicrobiële functies uitvoeren. Hun handel naar deze loci wordt georkestreerd door verschillende inflammatoire chemoattractanten, waaronder chemokines. Op moleculair niveau wordt chemoattractant signalering gereguleerd door de intracellulaire handel van de overeenkomstige receptoren. Het blijft echter onduidelijk hoe subcellulaire veranderingen in chemokinereceptoren de migratiedynamiek van leukocyten op cel- en weefselniveau beïnvloeden. Hier beschrijven we een methodologie voor live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemokinereceptordynamica bij neutrofielen tijdens ontstekingsreacties op weefselschade. Deze hulpmiddelen hebben aangetoond dat differentiële chemokinereceptorhandel in zebravisneutrofielen neutrofielenclustering en verspreiding op plaatsen van weefselbeschadiging coördineert. Dit heeft implicaties voor ons begrip van hoe ontstekingsreacties zichzelf oplossen. De beschreven hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om neutrofiele migratiepatronen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen te begrijpen en de methodologie kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren.
Leukocytenmigratie is van het grootste belang voor immuunresponsen. Immuuncellen zijn prototypische migrerende cellen, die opmerkelijk goed in staat zijn om weefsels en bloedvaten te doorkruisen en een reeks chemische geleidingssignalen te detecteren om richtingsgewijs naar microben of andere gastheercellen van belang te migreren. Correcte begeleiding is afhankelijk van de herkenning van chemoattractanten, waaronder chemokines de meest prominente categorie1 vertegenwoordigen. Chemokines worden herkend door zeer specifieke zeven-transmembraan G-eiwit gekoppelde receptoren. Na chemokinebinding veranderen chemokinereceptoren de conformatie, wat leidt tot de activering van geassocieerde trimerische G-eiwitten en hun dissociatie in functionele signaalsubeenheden die cytoskeletale veranderingen en gerichte migratie bevorderen1. Ten tweede worden chemokinereceptoren gefosforyleerd en deze modificatie leidt tot desensibilisatie voor lokstof, die kan worden gevolgd door snelle hersensibilisatie / recycling of intracellulaire afbraak en downregulatie van het celoppervlak2. Deze receptordynamiek beïnvloedt de duur en dosis signalering die door de cellen wordt ontvangen, maar hoe ze het migratiegedrag van leukocyten beïnvloeden, is in vivo moeilijk op te helderen.
Het volgen van receptordynamiek in levende leukocyten in traditionele zoogdiersystemen staat voor verschillende uitdagingen. Voor levend onderzoek moeten receptorfusies met fluorescerende eiwitten in de cellen tot expressie worden gebracht. Dit is een uitdaging in primaire leukocyten, met name bij neutrofielen, en studies tot nu toe hebben surrogaat neutrofiele cellijnen gebruikt om chemokinereceptoren tot expressie te brengen 3,4. Het genereren van transgene muismodellen, waarbij leukocyten een fluorescerende receptor of mutante receptoren tot expressie brengen met informatieve smokkeldefecten 5,6, brengt een aanzienlijke investering van tijd en middelen met zich mee. Zelfs in deze gevallen kunnen de beeldvormingsresolutie en het contrast voor beeldvormingsreceptordynamiek in het levende dier beperkt zijn en studies hebben immunohistochemie gebruikt op secties5 van vast weefsel. Gezien deze technische uitdagingen is ons begrip van hoe de dynamiek van chemoattractante receptoren het celgedrag in een levende weefselomgeving beïnvloedt momenteel beperkt.
Hier bieden we een methodologie om receptorhandel in zebravis neutrofielen te monitoren. Zebravissen zijn genetisch handelbaar, net als muizen, maar transgenese is relatief eenvoudiger door het gebruik van efficiënte transposonsystemen en directe zygote-manipulatie7. De transparante larve is idealiter vatbaar voor beeldvorming. De chemokinereceptordynamiek is gevisualiseerd in primordiale geslachtscellen en het laterale lijn primordium door expressie van overeenkomstige fusies met fluorescerende reporters 8,9,10. Zebravislarven zijn uitgerust met volwassen neutrofielen die sterk geconserveerde genetische en cellulaire eigenschappen hebben ten opzichte van neutrofielen van zoogdieren. Subcellulaire signaaldynamica zoals cytoskeletale dynamica en polariteitsregulatoren zijn in deze cellen gevisualiseerd door het genereren van overeenkomstige transgene lijnen 11,12,13. Onlangs hebben we de chemokinereceptordynamiek bij neutrofielen gevisualiseerd en functioneel geanalyseerd in de loop van ontstekingsreacties op weefselschade14. Hier beschrijven we het genereren van transgene reporterlijnen voor chemokine-signalering bij neutrofielen, voorbereiding van embryo’s voor live beeldvorming, een wondtest voor het bestuderen van neutrofielensignalering en het protocol voor het verkrijgen en analyseren van beelden. We bieden ook een zijprotocol om chemokinereceptorresponsen op kandidaat-liganden te testen, wat nuttig is bij het vaststellen van ligandherkenningspatronen in niet-gekarakteriseerde receptoren. Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met verdere genetische manipulaties, zoals remming van endogene chemokine-expressie of generatie van mutante receptoren met veranderde ligand-geïnduceerde handel, om te onderzoeken hoe specifieke signaaldynamiek het gedrag van leukocyten in vivo beïnvloedt. De transgene lijnen die fluorescerend gelabelde chemokinereceptoren tot expressie brengen, kunnen ook worden gebruikt als verslaggevers voor endogene chemokinegradiënten, die anders moeilijk te detecteren zijn door directe antilichaamkleuring. De beschreven methodologie biedt ruimte om het genereren van reporters uit te breiden naar andere immunosignalerende receptoren.
De beschreven methode maakt live beeldvorming mogelijk van receptordynamiek in reactie op endogene liganden in situ tijdens een ontstekingsreactie op weefselschade. Het gebruik van Cxcr1/Cxcr2 neutrofielenreporters kan worden uitgebreid naar andere fysiologische instellingen, zoals infectie, tumormodellen of andere soorten weefselschade 14,25,26,27. Bovendien kunnen transgene reddingslijnen, waarbij de endogene receptor wordt onderdrukt en gered door een exogene mutante receptor, nuttige hulpmiddelen bieden om het belang van specifieke neutrofiele migratiepatronen in immuunresponsen te ontleden. Cxcr1-receptormutanten die de desensibilisatie hebben aangetast, veroorzaken bijvoorbeeld meer prominente neutrofielenclustering op ontstekingsplaatsen14. Deze toename van functiefenotype kan worden gebruikt om de rol van neutrofiele congregatie in verschillende fysiologische processen te begrijpen, bijvoorbeeld wondherstel, infectieziekte of tumorevolutie, en receptor knockdown / knock-out experimenten aan te vullen. De methodologie biedt ook een basis om het bereik van beschikbare verslaggevers uit te breiden. De keuze van de fluorescerende verslaggever is belangrijk om te overwegen en hangt af van de biologische vraag. We vonden dat de constitutieve omzet van deze chemokinereceptoren in neutrofielen hoog was, in vergelijking met epitheelcellen, en dat verslaggevers met snelle rijping (bijv. sfGFP) membraanniveaus bij steady state moesten rapporteren en verschillen moesten oplossen bij neutrofiele stimulatie 8,14. Membraanverhoudingen van sfGFP / tagRFP zijn dus niet van toepassing voor het meten van ligand-geïnduceerde internalisatie in dit celtype, maar het patroon van tagRFP maakt het mogelijk om de intracellulaire lotgevallen van de receptor te volgen, wat nuttig zou kunnen zijn in sommige studies. We ontdekten ook dat het meer geconcentreerde intracellulaire signaal van tagRFP nuttig is voor het screenen van individuele larven. Een alternatieve benadering voor het meten van receptorniveaus bij het plasmamembraan zou zijn om een fluorescerende membraanmarker in neutrofielen co-express te brengen in hetzelfde transgen9 of in een onafhankelijk transgen14. In het eerste scenario zou het transgen een extra middel bieden voor het screenen van de vissen en zouden de expressieniveaus vergelijkbaar zijn tussen de marker en de receptor. De laatste aanpak zou meer modulair zijn, in die zin dat een zebravislijn met een receptorverslaggever kan worden gecombineerd met verschillende reporterlijnen. In beide gevallen is het vermeldenswaard dat membraankwantificering van de receptorniveaus een uitdaging is bij geclusterde neutrofielen (zie hieronder). Ten slotte merken we op dat een mogelijke uitbreiding van dit protocol zou zijn om de live beeldvorming door immunohistochemie op te volgen voor meer gedetailleerde lokalisatieanalyses.
Het Tol2-transgenesesysteem is goed ingeburgerd7 en de lysozym C-promotor is uitgebreid gebruikt voor neutrofiele expressie11,15. De transgenesebenadering is daarom relatief eenvoudig en het expressieniveau dat met deze promotor wordt bereikt, is hoog genoeg om voldoende contrast te bieden voor analyse van receptordynamiek. Een mogelijke beperking is dat het expressieniveau de endogene receptorexpressieniveaus niet samenvat. Nieuwe CRISPR-technologieën kunnen worden ingezet om knock-in-lijnen vast te stellen voor receptoren van bijzonder belang28. Deze technologieën zijn nog steeds omslachtig en garanderen mogelijk niet de vereiste expressieniveaus voor subcellulaire beeldvorming, maar hun succesvolle ontwikkeling zou een belangrijke doorbraak zijn voor het begrijpen van endogene signaleringsdynamiek. Functionele validaties zijn belangrijk voor het interpreteren van gegevens met transgene receptorconstructen. Ligandherkenningstests kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen dat het fluorescerende fusie-eiwit functioneel is en redding van knock-outfenotypen kan worden gebruikt om vast te stellen dat de transgene neutrofiele expressieniveaus compatibel zijn met functionaliteit14. Ten slotte zou een meer directe manier om de receptorfusie te valideren zijn om een in vitro functionele test te gebruiken met gelabelde receptor naast niet-gelabelde versies14.
De kwantificeringsbenadering richt zich op specifieke problemen bij nauwkeurige membraansegmentatie bij neutrofielen in vivo. In cellen van epitheliale aard kan kwantificering van receptorniveaus automatisch worden uitgevoerd door membraanreceptorniveaus te normaliseren tot een controlemarker, die in tandem of afzonderlijk kan worden uitgedrukt9. Inderdaad, we hebben een dergelijke benadering toegepast bij het gebruik van de ligand-herkenningstest in gastrulatende embryo’s14. Neutrofielen ondergaan echter complexe, snelle veranderingen in celvorm in vivo, waardoor de membraansegmentatie zowel in 2D als 3D14 moeilijk wordt. Dit is nog uitdagender wanneer neutrofielen clusteren, wat in veel fysiologische omgevingen voorkomt29. De contrastmetriek overwint deze beperking omdat het geen membraansegmentatie vereist, maar in plaats daarvan de algehele toestand van receptorverdeling in de cel weerspiegelt (vliezig / glad versus vesiculair / dotty). Het is belangrijk op te merken dat de contrastmetriek kan worden beïnvloed door het algehele contrast van het beeld, dus normalisatie van individuele celwaarden naar een interne referentie is vereist om rekening te houden met de variabiliteit van het signaal in verschillende embryo’s / monsters. We gebruikten bijvoorbeeld de gemiddelde celcontrastwaarde van niet-responsieve neutrofielen in de CHT (d.w.z. neutrofielen die stationair blijven en niet migreren naar de ventrale vin)14. Een extra mogelijkheid zou zijn om te normaliseren met contrastwaarden van een controlemarker in dezelfde cel. Dit zou een oplossing bieden wanneer een interne referentie van niet-reagerende cellen niet beschikbaar is en kan waarschijnlijk fijnere kwantitatieve verschillen in receptordynamiek tussen verschillende omstandigheden oplossen.
De locatie van beeldvorming is een andere variabele om te overwegen. De reden om hier de ventrale vinwond te kiezen, in tegenstelling tot het meer algemeen gebruikte staartvin wondmodel16,30, is omdat de plaats van verwonding in de buurt ligt van de plaats van neutrofiele woonplaats / migratie-oorsprong. Dit versnelt de tijdlijn van de test, omdat het relatief weinig tijd kost voordat neutrofielen arriveren. Bovendien biedt het de mogelijkheid om celgedrag vast te leggen, zowel bij de migratieoorsprong (CHT) als bij de doellocatie van belang (wond). Dit is hier relevant, omdat de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is voor subcellulaire beeldvorming moeilijk te combineren is met een groot gezichtsveld of multi-positie scannen. De ventrale vin wondtest maakt het dus mogelijk om de evolutie van de migratierespons van de migratieoorsprong te volgen en gelijktijdige vangst van niet-specifieke receptorfluctuaties in cellen die niet reageren. Zoals hierboven vermeld, is dit laatste nuttig voor kwantificeringsdoeleinden omdat het een interne referentie biedt voor niet-specifieke dynamiek. In andere systemen is het mogelijk dat een dergelijke interne referentie niet mogelijk is, in welk geval de contrastwaarden van een co-uitgedrukte membraanmarker een alternatieve regeling zouden bieden.
Samenvattend verwachten we dat de methodologie toepasbaar is op andere systemen en voor verschillende doeleinden kan worden ingezet. Dezelfde verslaggevers kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in andere inflammatoire omgevingen, zoals infectie-instellingen of andere ziektemodellen. Het repertoire van zebravisreceptor reporterlijnen kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren, om signaleringsmechanismen te begrijpen of liganddynamica in vivo te rapporteren. De aanpak kan worden gecombineerd met knockdown/knockout technieken om de mechanistische basis van de waargenomen dynamiek te ondervragen. Verstoring van ligandexpressie kan bijvoorbeeld wijzen op de ligandafhankelijkheid voor waargenomen receptordynamiek. In de toekomst voorzien we dat het systeem verder verfijnd kan worden om knock-in insertie van verslaggevers op te nemen. Uiteindelijk zouden bevindingen met behulp van deze methodologie nieuwe inzichten opleveren die waardevol zijn buiten de zebravisgemeenschap, gezien het behoud van deze signaalreceptoren bij zoogdieren en de relatieve uitdaging om deze studies in grotere organismen uit te voeren.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Christine Holt en Bill Harris voor hun hulp bij confocale microscopie. We bedanken Darren Gilmour voor de fluorescerende timer backbone constructs en Anna Huttenlocher voor de Tol2-Lyz backbone vector. We bedanken Steve Renshaw voor de Tg(mpx:GFP)i114 lijn. Dit werk werd ondersteund door de MRC (MR/L019523/1), de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] en een Isaac Newton Trust grant 19.23(n). C.C. werd ondersteund door een MRC DTP-studentschap en gedeeltelijk door de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie. H.W. werd ondersteund door een MRC DTP Studentship. H.P. werd ondersteund door een Wellcome Trust PhD beurs (105391/Z/14/Z) en deels door een Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie en de MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |