هنا نصف بروتوكولات إجراء التصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الجاذب الكيميائي في عدلات أسماك الزرد
توجيه الكريات البيض عن طريق التدرجات الكيميائية ضروري للاستجابات المناعية. العدلات هي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها إلى مواقع تلف الأنسجة حيث تقوم بتنفيذ وظائف حاسمة مضادة للميكروبات. يتم تنظيم الاتجار بهم إلى هذه المواقع من قبل العديد من الجاذبات الكيميائية الالتهابية ، بما في ذلك chemokines. على المستوى الجزيئي ، يتم تنظيم إشارات الجاذب الكيميائي من خلال الاتجار داخل الخلايا للمستقبلات المقابلة. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تؤثر التغيرات تحت الخلوية في مستقبلات الكيموكين على ديناميكيات هجرة الكريات البيض على مستوى الخلايا والأنسجة. هنا نصف منهجية للتصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الكيموكاين في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة. وقد كشفت هذه الأدوات أن الاتجار بمستقبلات الكيموكين التفاضلية في عدلات أسماك الزرد ينسق تجمع العدلات وتشتتها في مواقع تلف الأنسجة. هذا له آثار على فهمنا لكيفية حل الاستجابات الالتهابية ذاتيا. ويمكن استخدام الأدوات الموصوفة لفهم أنماط هجرة العدلات في مجموعة متنوعة من البيئات الفسيولوجية والمرضية، ويمكن توسيع نطاق المنهجية لتشمل مستقبلات إشارات أخرى.
هجرة الكريات البيض لها أهمية قصوى للاستجابات المناعية. الخلايا المناعية هي خلايا مهاجرة نموذجية ، وهي قادرة بشكل ملحوظ على عبور الأنسجة والأوعية الدموية واستشعار مجموعة من إشارات التوجيه الكيميائي للهجرة في الاتجاه نحو الميكروبات أو الخلايا المضيفة الأخرى ذات الأهمية. يعتمد التوجيه الصحيح على التعرف على الجاذبات الكيميائية ، من بينها الكيموكينات التي تمثل الفئة1 الأبرز. يتم التعرف على الكيموكينات من خلال مستقبلات محددة للغاية من البروتين G عبر الغشاء المقترن. عند ربط الكيموكين ، تغير مستقبلات الكيموكين التشكيل مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات G الثلاثية المرتبطة بها وانفصالها إلى وحدات فرعية وظيفية للإشارة تعزز التغيرات الهيكلية الخلوية والهجرة الموجهة1. ثانيا ، يتم فسفور مستقبلات الكيموكين ، ويؤدي هذا التعديل إلى إزالة الحساسية إلى الجاذب ، والذي يمكن أن يتبعه إعادة تحسس / إعادة تدوير سريعة أو تدهور داخل الخلايا وخفض التنظيم من سطح الخلية2. تؤثر ديناميكيات المستقبلات هذه على مدة وجرعة الإشارات التي تتلقاها الخلايا ولكن من الصعب توضيح كيفية تأثيرها على سلوك هجرة الكريات البيض في الجسم الحي.
يواجه تتبع ديناميكيات المستقبلات في الكريات البيض الحية في أنظمة الثدييات التقليدية العديد من التحديات. بالنسبة للدراسات الحية ، يجب التعبير عن اندماج المستقبلات مع البروتينات الفلورية في الخلايا. هذا أمر صعب في الكريات البيض الأولية ، وخاصة في العدلات ، وقد استخدمت الدراسات حتى الآن خطوط خلايا العدلات البديلة للتعبير عن مستقبلات الكيموكين 3,4. إن توليد نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، التي تعبر فيها الكريات البيض عن مستقبلات الفلورسنت أو المستقبلات المتحولة ذات عيوب الاتجار بالمعلومات 5,6 ، يستلزم استثمارا كبيرا في الوقت والموارد. حتى في هذه الحالات ، يمكن أن تكون دقة التصوير والتباين لديناميكيات مستقبلات التصوير في الحيوان الحي محدودة وقد استخدمت الدراسات الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة5. وبالنظر إلى هذه التحديات التقنية، فإن فهمنا لكيفية تأثير ديناميكيات مستقبلات الجاذبات الكيميائية على سلوك الخلايا في بيئة الأنسجة الحية محدود حاليا.
هنا نقدم منهجية لرصد الاتجار بالمستقبلات في عدلات أسماك الزرد. الزرد قابل للسحب وراثيا ، مثل الفئران ، ولكن التحول أكثر وضوحا نسبيا من خلال استخدام أنظمة transposon الفعالة والتلاعب المباشر بالزيجوت7. اليرقة الشفافة قابلة للتصوير بشكل مثالي. تم تصور ديناميكيات مستقبلات الكيموكين في الخلايا الجرثومية البدائية والخط الجانبي البدائي من خلال التعبير عن الانصهارات المقابلة مع مراسلي الفلورسنت8،9،10. تم تجهيز يرقات أسماك الزرد بالعدلات الناضجة التي لها خصائص وراثية وخلوية محفوظة للغاية فيما يتعلق بالعدلات الثديية. تم تصور ديناميكيات الإشارات تحت الخلوية مثل ديناميكيات الهيكل الخلوي ومنظمات القطبية في هذه الخلايا عن طريق توليد خطوط معدلة وراثيا مقابلة11،12،13. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتصور وتحليل ديناميكيات مستقبلات الكيموكين وظيفيا في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة14. هنا ، نصف توليد خطوط المراسل المعدلة وراثيا لإشارات الكيموكين في العدلات ، وإعداد الأجنة للتصوير الحي ، وفحص الجرح لدراسة إشارات العدلات وبروتوكول الحصول على الصور وتحليلها. كما نقدم بروتوكولا جانبيا لاختبار استجابات مستقبلات الكيموكين للروابط المرشحة ، وهو أمر مفيد عند محاولة إنشاء أنماط التعرف على الليغاند في المستقبلات غير المميزة. يمكن استخدام هذه التقنيات بالاقتران مع المزيد من التلاعب الجيني ، مثل تثبيط تعبير الكيموكين الداخلي أو توليد المستقبلات المتحولة مع الاتجار المتغير الناجم عن الرباط ، لاستجواب كيفية تأثير ديناميكيات الإشارات المحددة على سلوك الكريات البيض في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام الخطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبلات الكيموكين الموسومة بالفلورسنت كمراسلين لتدرجات الكيموكين الذاتية المنشأ ، والتي يصعب اكتشافها عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة المباشر. توفر المنهجية الموصوفة مجالا لتوسيع نطاق توليد المراسلين ليشمل مستقبلات أخرى للإشارات المناعية.
تسمح الطريقة الموصوفة بالتصوير الحي لديناميات المستقبلات استجابة للروابط الداخلية في الموقع أثناء الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. يمكن توسيع استخدام مراسلات العدلات Cxcr1 / Cxcr2 ليشمل إعدادات فسيولوجية أخرى ، مثل العدوى أو نماذج الأورام أو أنواع أخرى من تلف الأنسجة14،25،26،27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر خطوط الإنقاذ المعدلة وراثيا، التي يتم فيها قمع المستقبل الداخلي وإنقاذه بواسطة مستقبل متحور خارجي، أدوات مفيدة لتشريح أهمية أنماط هجرة العدلات المحددة في الاستجابات المناعية. على سبيل المثال ، تسبب طفرات مستقبلات Cxcr1 التي أضعفت إزالة الحساسية تجمعا أكثر بروزا في العدلات في المواقع الالتهابية14. يمكن استخدام هذا الكسب من النمط الظاهري الوظيفي لفهم دور تجمع العدلات في العمليات الفسيولوجية المختلفة ، على سبيل المثال ، إصلاح الجروح ، والأمراض المعدية ، أو تطور الورم ، واستكمال تجارب الضربة القاضية / الضربة القاضية للمستقبلات. وتوفر المنهجية أيضا أساسا لتوسيع نطاق المراسلين المتاحين. من المهم النظر في اختيار مراسل الفلورسنت ويعتمد على السؤال البيولوجي. وجدنا أن معدل الدوران التأسيسي لمستقبلات الكيموكين هذه في العدلات كان مرتفعا ، مقارنة بالخلايا الظهارية ، وأن المراسلين ذوي النضج السريع (على سبيل المثال ، sfGFP) كانوا مطالبين بالإبلاغ عن مستويات الغشاء في حالة ثابتة وحل الاختلافات حول تحفيز العدلات 8,14. وبالتالي ، فإن نسب الغشاء من sfGFP / tagRFP لا تنطبق على قياس الاستيعاب الناجم عن الليغاند في هذا النوع من الخلايا ، ولكن نمط tagRFP يسمح بتتبع المصائر داخل الخلايا للمستقبل ، والتي قد تكون مفيدة في بعض الدراسات. وجدنا أيضا أن الإشارة داخل الخلايا الأكثر تركيزا من tagRFP مفيدة لفحص اليرقات الفردية. وهناك نهج بديل لقياس مستويات المستقبلات في غشاء البلازما يتمثل في التعبير المشترك عن علامة غشاء الفلورسنت في العدلات إما في نفس الجين المحور9 أو في الجين14 المستقل المتحول. في السيناريو الأول ، سيوفر الجين المحور وسيلة إضافية لفحص الأسماك وستكون مستويات التعبير قابلة للمقارنة بين العلامة والمستقبل. سيكون النهج الأخير أكثر معيارية ، حيث يمكن دمج خط الزرد مع مراسل مستقبلات مع خطوط مراسل مختلفة. في كلتا الحالتين ، تجدر الإشارة إلى أن تحديد كمية الغشاء لمستويات المستقبلات يمثل تحديا في العدلات العنقودية (انظر أدناه). وأخيرا، نلاحظ أن التمديد المحتمل لهذا البروتوكول هو متابعة التصوير الحي بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية لإجراء تحليلات توطين أكثر تفصيلا.
نظام Tol2 transgenesis راسخ7 وتم استخدام مروج الليزوزيم C على نطاق واسع للتعبير عن العدلات11,15. وبالتالي ، فإن نهج التكوين المتبادل مباشر نسبيا ومستوى التعبير الذي تم تحقيقه مع هذا المروج مرتفع بما يكفي لتوفير تباين كاف لتحليل ديناميكيات المستقبلات. أحد القيود المحتملة هو أن مستوى التعبير لا يلخص مستويات التعبير عن المستقبلات الذاتية. ويمكن نشر تقنيات كريسبر الجديدة لإنشاء خطوط غير مباشرة للمستقبلات ذات الأهمية الخاصة28. لا تزال هذه التقنيات مرهقة وقد لا تضمن مستويات التعبير المطلوبة للتصوير تحت الخلوي ، لكن تطويرها الناجح سيكون اختراقا مهما لفهم ديناميكيات الإشارات الذاتية. تعد عمليات التحقق الوظيفية مهمة لتفسير البيانات باستخدام تركيبات المستقبلات المعدلة وراثيا. على سبيل المثال ، يمكن استخدام اختبارات التعرف على الليغاند لإثبات أن بروتين الاندماج الفلوري وظيفي ويمكن استخدام إنقاذ الأنماط الظاهرية بالضربة القاضية لإثبات أن مستويات التعبير العدلة المعدلة وراثيا متوافقة مع الوظيفة14. وأخيرا، فإن الطريقة الأكثر مباشرة للتحقق من صحة اندماج المستقبلات هي استخدام اختبار وظيفي في المختبر مع مستقبلات موسومة إلى جانب الإصدارات14 غير المصنفة.
يعالج نهج القياس الكمي صعوبات محددة في تجزئة الأغشية الدقيقة في العدلات في الجسم الحي. في الخلايا ذات الطبيعة الظهارية ، يمكن تنفيذ القياس الكمي لمستويات المستقبلات تلقائيا عن طريق تطبيع مستويات مستقبلات الغشاء إلى علامة تحكم ، والتي يمكن التعبير عنها جنبا إلى جنب أو بشكل منفصل9. في الواقع ، لقد طبقنا مثل هذا النهج ، عند استخدام اختبار التعرف على الليغاند في أجنة المعدة14. ومع ذلك ، تخضع العدلات لتغيرات معقدة وسريعة في شكل الخلية في الجسم الحي ، مما يجعل تجزئة الغشاء صعبة في كل من 2D و 3D14. هذا أكثر تحديا عندما تتجمع العدلات ، والتي تحدث في العديد من الإعدادات الفسيولوجية29. يتغلب مقياس التباين على هذا القيد لأنه لا يتطلب تجزئة الغشاء ولكنه يعكس بدلا من ذلك الحالة العامة لتوزيع المستقبلات في الخلية (غشائية / ناعمة مقابل حويصلة / نقطة). من المهم ملاحظة أن مقياس التباين يمكن أن يتأثر بالتباين الكلي للصورة ، لذلك يلزم تطبيع قيم الخلايا الفردية إلى مرجع داخلي لحساب تباين الإشارة في الأجنة / العينات المختلفة. على سبيل المثال، استخدمنا متوسط قيمة تباين الخلايا للعدلات غير المستجيبة في CHT (أي العدلات التي تظل ثابتة ولا تهاجر إلى الزعنفة البطنية)14. وهناك احتمال إضافي يتمثل في التطبيع مع قيم التباين لعلامة تحكم في نفس الخلية. وهذا من شأنه أن يوفر حلا عندما لا يتوفر مرجع داخلي للخلايا غير المستجيبة وقد يحل على الأرجح الاختلافات الكمية الدقيقة في ديناميكيات المستقبلات بين الظروف المختلفة.
موقع التصوير هو متغير آخر يجب مراعاته. سبب اختيار جرح الزعنفة البطنية هنا ، على عكس نموذج جرح زعنفة الذيل الأكثر استخداما16,30 ، هو أن موقع الجرح قريب من موقع إقامة العدلات / أصل الهجرة. هذا يسرع الجدول الزمني للفحص ، حيث يستغرق الأمر وقتا قليلا نسبيا حتى تصل العدلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة لالتقاط سلوك الخلية في كل من أصل الهجرة (CHT) والموقع المستهدف للاهتمام (الجرح). هذا مهم هنا ، لأن الدقة المكانية والزمانية المطلوبة للتصوير تحت الخلوي يصعب دمجها مع مجال رؤية كبير أو مسح ضوئي متعدد المواضع. وبالتالي ، فإن فحص جرح الزعنفة البطنية يسمح بتتبع تطور استجابة الهجرة من أصل الهجرة والتقاط تقلبات المستقبلات غير المحددة في الخلايا التي لا تستجيب في وقت واحد. وكما ذكر أعلاه، فإن هذا الأخير مفيد لأغراض القياس الكمي لأنه يوفر مرجعا داخليا للديناميات غير المحددة. وفي نظم أخرى، قد لا يكون من الممكن الحصول على مثل هذا المرجع الداخلي، وفي هذه الحالة توفر قيم التباين لعلامة غشاء مشتركة التعبير عنها تحكما بديلا.
وباختصار، نتوقع أن تكون المنهجية قابلة للتطبيق على النظم الأخرى ويمكن نشرها لأغراض متنوعة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نفس المراسلين في إعدادات التهابية أخرى ، مثل إعدادات العدوى أو نماذج الأمراض الأخرى. يمكن توسيع ذخيرة خطوط مراسل مستقبلات الزرد إلى مستقبلات إشارات أخرى ، لفهم آليات الإشارة أو الإبلاغ عن ديناميكيات الليغاند في الجسم الحي. يمكن الجمع بين هذا النهج وتقنيات الضربة القاضية / الضربة القاضية لاستجواب الأساس الميكانيكي للديناميكيات المرصودة. على سبيل المثال ، يمكن أن يشير اضطراب تعبير الرباط إلى اعتماد الليغاند على ديناميكيات المستقبلات المرصودة. وفي المستقبل، نتوخى أن يتم زيادة صقل النظام ليشمل الإدخال غير المباشر للمراسلين. وفي نهاية المطاف، فإن النتائج التي تستخدم هذه المنهجية من شأنها أن توفر رؤى جديدة قيمة تتجاوز مجتمع أسماك الزرد، بالنظر إلى الحفاظ على مستقبلات الإشارات هذه في الثدييات والتحدي النسبي المتمثل في إجراء هذه الدراسات على الكائنات الحية الأكبر.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كريستين هولت وبيل هاريس على المساعدة في الفحص المجهري البؤري. نشكر دارين غيلمور على تركيبات العمود الفقري لمؤقت الفلورسنت وآنا هوتنلوتشر على ناقل العمود الفقري Tol2-Lyz. نشكر ستيف رينشو على خط Tg (mpx: GFP) i114 . وقد دعم هذا العمل مركز البحوث والبحوث (MR/L019523/1)، وصندوق ويلكوم الاستئماني [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] ومنحة إسحاق نيوتن ترست 19.23 (ن). C.C. بدعم من منحة MRC DTP وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] منحة. تم دعم H.W. من قبل MRC DTP Studentship. تم دعم H.P. من خلال منحة الدكتوراه Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ منحة إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] و MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |