在这里,我们描述了对斑马鱼嗜中性粒细胞的化学引诱剂受体动力学进行实时成像和定量分析的方案。
通过化学梯度引导白细胞对于免疫反应至关重要。中性粒细胞是第一批被招募到组织损伤部位的细胞,在那里它们执行关键的抗菌功能。它们被贩运到这些位点是由几种炎症性化学诱捕剂(包括趋化因子)精心策划的。在分子水平上,化学吸引剂信号传导受相应受体的细胞内运输的调节。然而,目前尚不清楚趋化因子受体的亚细胞变化如何影响细胞和组织水平的白细胞迁移动力学。在这里,我们描述了一种在组织损伤的炎症反应期间,中性粒细胞趋化因子受体动力学的实时成像和定量分析的方法。这些工具表明,斑马鱼中性粒细胞中差异化因子受体的运转协调中性粒细胞聚集和在组织损伤部位的扩散。这对我们理解炎症反应如何自我解决具有重要意义。所描述的工具可用于了解各种生理和病理环境中的嗜中性粒细胞迁移模式,并且该方法可以扩展到其他信号传导受体。
白细胞迁移对免疫反应至关重要。免疫细胞是典型的迁移细胞,它们非常能够穿越组织和血管,并感知一系列化学引导线索,以定向地向微生物或其他重要的宿主细胞迁移。正确的指导依赖于对化学牵连剂的识别,其中趋化因子代表了最突出的类别1。趋化因子由高度特异性的七跨膜G蛋白偶联受体识别。在趋化因子结合后,趋化因子受体改变构象,导致相关的三聚体G蛋白的活化及其解离成功能信号子亚基,促进细胞骨架变化和定向迁移1。其次,趋化因子受体被磷酸化,并且这种修饰导致对引诱剂的脱敏,随后可以从细胞表面2快速再敏化/再循环或细胞内降解和下调。这些受体动力学影响细胞接收的信号传导的持续时间和剂量,但它们如何影响白细胞迁移行为在体内很难阐明。
在传统哺乳动物系统中跟踪活白细胞中的受体动力学面临几个挑战。对于现场研究,受体与荧光蛋白的融合必须在细胞中表达。这在原代白细胞中具有挑战性,特别是在嗜中性粒细胞中,迄今为止的研究已经使用替代中性粒细胞系来表达趋化因子受体3,4。生成转基因小鼠模型,其中白细胞表达荧光受体或具有信息性贩运缺陷的突变受体5,6,需要投入大量的时间和资源。即使在这些情况下,活体动物中成像受体动力学的成像分辨率和对比度也可能受到限制,并且研究已经在固定组织切片中使用了免疫组化学5。鉴于这些技术挑战,我们对化学吸引受体动力学如何影响活组织环境中的细胞行为的理解目前有限。
在这里,我们提供了一种监测斑马鱼中性粒细胞受体运输的方法。斑马鱼在遗传上是可处理的,像老鼠一样,但通过使用有效的转座子系统和直接的受精卵操作7,转基因相对更直接。透明幼虫非常适合成像。趋化因子受体动力学已通过与荧光报告基因8,9,10的相应融合表达在原始生殖细胞和侧线原始中可视化。斑马鱼幼虫具有成熟的嗜中性粒细胞,与哺乳动物中性粒细胞相比具有高度保守的遗传和细胞特性。亚细胞信号动力学,如细胞骨架动力学和极性调节因子,已经通过产生相应的转基因品系11,12,13在这些细胞中可视化。最近,我们可视化并功能分析了中性粒细胞在组织损伤炎症反应过程中的趋化因子受体动力学14。在这里,我们描述了嗜中性粒细胞趋化因子信号传导的转基因报告线的产生,用于实时成像的胚胎制备,用于研究嗜中性粒细胞信号传导的伤口测定以及用于获取和分析图像的方案。我们还提供了一种侧方案来测试趋化因子受体对候选配体的反应,这在尝试在未表征的受体中建立配体识别模式时很有用。这些技术可以与进一步的遗传操作结合使用,例如抑制内源性趋化因子表达或产生具有改变配体诱导的运输的突变受体,以询问特异性信号动力学如何影响体内白细胞行为。表达荧光标记的趋化因子受体的转基因品系也可以用作内源性趋化因子梯度的报告基因,否则很难通过直接抗体染色检测到。所描述的方法为将报告基因的产生扩展到其他免疫信号传导受体提供了空间。
所描述的方法允许在对组织损伤的炎症反应期间原位响应于内源性配体的受体动力学的实时成像。Cxcr1/ Cxcr2嗜中性粒细胞报告基因的使用可以扩展到其他生理环境,例如感染,肿瘤模型或其他类型的组织损伤14,25,26,27。此外,转基因抢救系,其中内源性受体被外源性突变受体抑制和挽救,可以为剖析特定中性粒细胞迁移模式在免疫反应中的重要性提供有用的工具。例如,具有脱敏受损的Cxcr1受体突变体在炎症部位14引起更突出的中性粒细胞聚集。这种功能表型的增益可用于了解中性粒细胞聚集在不同生理过程中的作用,例如伤口修复,传染病或肿瘤进化,以及补充受体敲低/敲除实验。该方法还为扩大现有报告员的范围提供了基础。荧光报告基因的选择很重要,取决于生物学问题。我们发现,与上皮细胞相比,中性粒细胞中这些趋化因子受体的组成性周转率很高,并且具有快速成熟(例如sfGFP)的报告基因需要在稳态下报告膜水平并解析中性粒细胞刺激时的差异8,14。因此,sfGFP / tagRFP的膜比不适用于测量配体诱导的这种细胞类型的内化,但tagRFP的模式允许跟踪受体的细胞内命运,这可能在某些研究中有用。我们还发现,tagRFP更集中的细胞内信号对于筛选单个幼虫是有用的。测量质膜上受体水平的另一种方法是在同一转基因9 或独立转基因14中的嗜中性粒细胞中共表达荧光膜标记物。在前一种情况下,转基因将为筛选鱼类提供额外的手段,并且标记物和受体之间的表达水平相当。后一种方法将更加模块化,因为带有受体报告器的斑马鱼线可以与不同的报告线组合。在任何一种情况下,值得注意的是,在聚集性中性粒细胞中,受体水平的膜定量具有挑战性(见下文)。最后,我们注意到该协议的可能扩展是通过免疫组织化学跟踪实时成像,以进行更详细的定位分析。
Tol2转基因系统已建立7 ,溶菌酶C启动子已被广泛用于中性粒细胞表达11,15。因此,转基因方法相对简单,并且使用该启动子达到的表达水平足够高,可以为分析受体动力学提供足够的对比度。一个可能的局限性是表达水平不概括内源性受体表达水平。可以部署新的CRISPR技术来为特别感兴趣的受体建立敲入线28。这些技术仍然很麻烦,可能无法保证亚细胞成像所需的表达水平,但它们的成功开发将是理解内源性信号传导动力学的重要突破。功能验证对于用转基因受体构建体解释数据非常重要。例如,配体识别测定可用于确定荧光融合蛋白具有功能性,并且可用于拯救敲除表型以确定转基因嗜中性粒细胞表达水平与功能14相容。最后,验证受体融合的更直接方法是利用体外功能测定,将标记的受体与未标记的版本14一起使用。
定量方法解决了体内嗜中性粒细胞准确膜分割的特定困难。在上皮性质的细胞中,可以通过将膜受体水平归一化为对照标记物来自动执行受体水平的定量,其可以串联或单独表达9。事实上,我们已经应用了这种方法,当在胃压胚胎中使用配体识别测定14时。然而,嗜中性粒细胞在体内经历复杂,快速的细胞形状变化,使得在2D和3D14中膜分割困难。当嗜中性粒细胞聚集时,这更具挑战性,这发生在许多生理环境中29。造影剂克服了这一限制,因为它不需要膜分割,而是反映了细胞中受体分布的整体状态(膜性/光滑性与囊泡性/点状)。重要的是要注意,对比度指标可能会受到图像整体对比度的影响,因此需要将单个细胞值归一化为内部参考,以考虑不同胚胎/样品中信号的变异性。例如,我们使用了CHT中无反应性嗜中性粒细胞的平均细胞对比度值(即,保持静止且不会迁移到腹鳍的嗜中性粒细胞)14。另一种可能性是使用同一单元格中对照标记的对比度值进行归一化。当无反应细胞的内部参考不可用时,这将提供一种解决方案,并且可能解决不同条件之间受体动力学的更精细的定量差异。
影像学检查的位置是另一个需要考虑的变量。这里选择腹鳍伤口的原因,而不是更常用的尾鳍伤口模型16,30,是因为伤口部位靠近嗜中性粒细胞居住/迁移起源的部位。这加快了测定的时间线,因为中性粒细胞到达所需的时间相对较短。此外,它还提供了在迁移源(CHT)和目标位置(伤口)捕获细胞行为的机会。这在这里是相关的,因为亚细胞成像所需的空间和时间分辨率很难与大视场或多位置扫描相结合。因此,腹鳍伤口测定允许跟踪迁移反应从迁移起源的进化,并同时捕获无反应细胞中的非特异性受体波动。如上所述,后者对于量化目的很有用,因为它为非特异性动力学提供了内部参考。在其他系统中,可能不可能有这样的内部参考,在这种情况下,共表达膜标记物的对比度值将提供替代对照。
总之,我们预计该方法适用于其他系统,并且可以用于各种目的。例如,相同的报告基因可用于其他炎症环境,如感染环境或其他疾病模型。斑马鱼受体报告基因系的库可以扩展到其他信号传导受体,以了解信号传导机制或报告体内配体动力学。该方法可以与敲低/敲除技术相结合,以询问观察到的动力学的机制基础。例如,配体表达的扰动可以指示配体对观察到的受体动力学的依赖性。未来,我们设想可以进一步完善该系统,以纳入记者的敲入插入。最终,使用这种方法的研究结果将为斑马鱼群落之外提供有价值的新见解,因为哺乳动物中这些信号受体的保护以及在大型生物体中进行这些研究的相对挑战。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Christine Holt和Bill Harris在共聚焦显微镜方面的帮助。我们感谢Darren Gilmour的荧光计时器骨干结构,感谢Anna Huttenlocher的Tol2-Lyz骨干载体。我们感谢Steve Renshaw的Tg(mpx:GFP)i114 系列。这项工作得到了MRC(MR/L019523/1)、惠康信托基金会[204845/Z/16/Z]的支持。艾萨克·牛顿信托[12.21(a)i]和艾萨克·牛顿信托赠款19.23(n)。C.C.得到了MRC DTP学生奖学金的支持,部分得到了惠康信托基金会的支持[204845/Z/16/Z];艾萨克·牛顿信托 [12.21(a)i] 授予。H.W.得到了MRC DTP学生会的支持。H.P.得到了惠康信托博士奖学金(105391/Z/14/Z)的支持,部分得到了惠康信托[204845/Z/16/Z]的支持。Isaac Newton Trust [12.21(a)i] 授予和 MRC (MR/L019523/1)。
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |