Qui descriviamo i protocolli per eseguire l’imaging dal vivo e l’analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish
La guida dei leucociti da parte di gradienti chimici è essenziale per le risposte immunitarie. I neutrofili sono le prime cellule ad essere reclutate in siti di danno tissutale dove eseguono funzioni antimicrobiche cruciali. Il loro traffico verso questi loci è orchestrato da diversi chemioattrattivi infiammatori, tra cui le chemochine. A livello molecolare, la segnalazione chemioattrattante è regolata dal traffico intracellulare dei recettori corrispondenti. Tuttavia, non è chiaro come i cambiamenti subcellulari nei recettori delle chemochine influenzino le dinamiche di migrazione dei leucociti a livello cellulare e tissutale. Qui descriviamo una metodologia per l’imaging dal vivo e l’analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori delle chemochine nei neutrofili durante le risposte infiammatorie al danno tissutale. Questi strumenti hanno rivelato che il traffico differenziale del recettore delle chemochine nei neutrofili del pesce zebra coordina il raggruppamento e la dispersione dei neutrofili nei siti di danno tissutale. Ciò ha implicazioni per la nostra comprensione di come le risposte infiammatorie sono auto-risolte. Gli strumenti descritti potrebbero essere utilizzati per comprendere i modelli di migrazione dei neutrofili in una varietà di contesti fisiologici e patologici e la metodologia potrebbe essere estesa ad altri recettori di segnalazione.
La migrazione dei leucociti è di fondamentale importanza per le risposte immunitarie. Le cellule immunitarie sono cellule migratorie prototipiche, che sono notevolmente in grado di attraversare tessuti e vasi sanguigni e di percepire una serie di segnali di guida chimica per migrare direzionalmente verso microbi o altre cellule ospiti importanti. Una guida corretta si basa sul riconoscimento dei chemioattrattivi, tra cui le chemochine rappresentano la categoria1 più importante. Le chemochine sono riconosciute da recettori accoppiati a sette proteine G transmembrana altamente specifici. Al momento del legame con le chemochine, i recettori delle chemochine cambiano conformazione portando all’attivazione delle proteine G trimeriche associate e alla loro dissociazione in subunità di segnalazione funzionale che promuovono i cambiamenti citoscheletrici e la migrazione diretta1. Secondariamente, i recettori delle chemochine sono fosforilati e questa modifica porta alla desensibilizzazione all’attrattivo, che può essere seguita da una rapida risensibilizzazione / riciclaggio o degradazione intracellulare e down-regolazione dalla superficie cellulare2. Queste dinamiche dei recettori influenzano la durata e la dose di segnalazione ricevuta dalle cellule, ma il modo in cui influenzano il comportamento di migrazione dei leucociti è stato difficile da chiarire in vivo.
Il monitoraggio delle dinamiche dei recettori nei leucociti vivi nei sistemi tradizionali dei mammiferi deve affrontare diverse sfide. Per gli studi dal vivo, le fusioni di recettori con proteine fluorescenti devono essere espresse nelle cellule. Questo è difficile nei leucociti primari, in particolare nei neutrofili, e gli studi finora hanno utilizzato linee cellulari neutrofile surrogate per esprimere i recettori delle chemochine 3,4. La generazione di modelli murini transgenici, in cui i leucociti esprimono un recettore fluorescente o recettori mutanti con difetti di traffico informativo 5,6, comporta un notevole investimento di tempo e risorse. Anche in questi casi, la risoluzione e il contrasto di imaging per le dinamiche dei recettori di imaging nell’animale vivo possono essere limitati e gli studi hanno utilizzato l’immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse5. Date queste sfide tecniche, la nostra comprensione di come le dinamiche dei recettori chemioattrattivi influenzano il comportamento cellulare in un ambiente di tessuto vivo è attualmente limitata.
Qui forniamo una metodologia per monitorare il traffico di recettori nei neutrofili zebrafish. I pesci zebra sono geneticamente trattabili, come i topi, ma la transgenesi è relativamente più semplice attraverso l’uso di sistemi di trasposoni efficienti e la manipolazione diretta dello zigote7. La larva trasparente è idealmente suscettibile di imaging. Le dinamiche del recettore delle chemochine sono state visualizzate nelle cellule germinali primordiali e nella linea laterale primordium mediante espressione di fusioni corrispondenti con reporter fluorescenti 8,9,10. Le larve di zebrafish sono dotate di neutrofili maturi che hanno proprietà genetiche e cellulari altamente conservate rispetto ai neutrofili dei mammiferi. Le dinamiche di segnalazione subcellulare come la dinamica citoscheletrica e i regolatori di polarità sono stati visualizzati in queste cellule mediante la generazione di corrispondenti linee transgeniche 11,12,13. Recentemente, abbiamo visualizzato e analizzato funzionalmente le dinamiche del recettore delle chemochine nei neutrofili durante il corso delle risposte infiammatorie al danno tissutale14. Qui, descriviamo la generazione di linee reporter transgeniche per la segnalazione di chemochine nei neutrofili, la preparazione di embrioni per l’imaging dal vivo, un test delle ferite per lo studio della segnalazione dei neutrofili e il protocollo per l’acquisizione e l’analisi delle immagini. Forniamo anche un protocollo laterale per testare le risposte dei recettori delle chemochine ai ligandi candidati, che è utile quando si cerca di stabilire modelli di riconoscimento dei ligandi in recettori non caratterizzati. Queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione con ulteriori manipolazioni genetiche, come l’inibizione dell’espressione di chemochine endogene o la generazione di recettori mutanti con traffico alterato indotto dal ligando, per interrogarsi su come specifiche dinamiche di segnalazione influenzano il comportamento dei leucociti in vivo. Le linee transgeniche che esprimono recettori delle chemochine marcati fluorescentemente possono anche essere utilizzate come reporter per gradienti di chemochine endogene, che sono altrimenti difficili da rilevare mediante colorazione diretta degli anticorpi. La metodologia descritta fornisce la possibilità di espandere la generazione di reporter ad altri recettori di immuno-segnalazione.
Il metodo descritto consente l’imaging dal vivo della dinamica dei recettori in risposta a ligandi endogeni in situ durante una risposta infiammatoria al danno tissutale. L’uso di reporter neutrofili Cxcr1/Cxcr2 potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come infezioni, modelli tumorali o altri tipi di danno tissutale 14,25,26,27. Inoltre, le linee di salvataggio transgeniche, in cui il recettore endogeno viene soppresso e salvato da un recettore mutante esogeno, potrebbero fornire strumenti utili per analizzare l’importanza di specifici modelli di migrazione dei neutrofili nelle risposte immunitarie. Ad esempio, i mutanti del recettore Cxcr1 che hanno una desensibilizzazione compromessa causano un raggruppamento di neutrofili più prominente nei siti infiammatori14. Questo fenotipo di guadagno di funzione potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo della congregazione dei neutrofili in diversi processi fisiologici, ad esempio la riparazione delle ferite, le malattie infettive o l’evoluzione del tumore e integrare gli esperimenti di knockdown / knockout del recettore. La metodologia fornisce anche una base per ampliare la gamma di reporter disponibili. La scelta del reporter fluorescente è importante da considerare e dipende dalla questione biologica. Abbiamo scoperto che il turnover costitutivo di questi recettori delle chemochine nei neutrofili era elevato, rispetto alle cellule epiteliali, e che i reporter con maturazione rapida (ad esempio, sfGFP) erano tenuti a riportare i livelli di membrana allo stato stazionario e risolvere le differenze sulla stimolazione dei neutrofili 8,14. Pertanto, i rapporti di membrana di sfGFP / tagRFP non sono applicabili per misurare l’internalizzazione indotta dal ligando in questo tipo di cellula, ma il modello di tagRFP consente il monitoraggio dei destini intracellulari del recettore, che potrebbe essere utile in alcuni studi. Abbiamo anche scoperto che il segnale intracellulare più concentrato di tagRFP è utile per lo screening delle singole larve. Un approccio alternativo per misurare i livelli dei recettori sulla membrana plasmatica sarebbe quello di co-esprimere un marcatore di membrana fluorescente nei neutrofili nello stesso transgene9 o in un transgeneindipendente 14. Nel primo scenario il transgene fornirebbe un ulteriore mezzo per lo screening del pesce e i livelli di espressione sarebbero comparabili tra il marcatore e il recettore. Quest’ultimo approccio sarebbe più modulare, in quanto una linea zebrafish con un reporter recettore potrebbe essere combinata con diverse linee reporter. In entrambi i casi, vale la pena notare che la quantificazione di membrana dei livelli del recettore è difficile nei neutrofili raggruppati (vedi sotto). Infine, notiamo che una possibile estensione di questo protocollo sarebbe quella di seguire l’imaging dal vivo mediante immunoistochimica per analisi di localizzazione più dettagliate.
Il sistema di transgenesi Tol2 è ben consolidato7 e il promotore del lisozima C è stato ampiamente utilizzato per l’espressione dei neutrofili11,15. L’approccio della transgenesi è, quindi, relativamente semplice e il livello di espressione raggiunto con questo promotore è abbastanza alto da fornire un contrasto sufficiente per l’analisi della dinamica del recettore. Una possibile limitazione è che il livello di espressione non ricapitola i livelli di espressione del recettore endogeno. Nuove tecnologie CRISPR potrebbero essere implementate per stabilire linee knock-in per i recettori di particolare interesse28. Queste tecnologie sono ancora ingombranti e potrebbero non garantire i livelli di espressione richiesti per l’imaging subcellulare, ma il loro sviluppo di successo sarebbe un importante passo avanti per la comprensione delle dinamiche di segnalazione endogena. Le convalide funzionali sono importanti per interpretare i dati con costrutti recettoriali transgenici. Ad esempio, i saggi di riconoscimento dei ligandi possono essere utilizzati per stabilire che la proteina di fusione fluorescente è funzionale e il salvataggio dei fenotipi knockout potrebbe essere utilizzato per stabilire che i livelli di espressione transgenica dei neutrofili sono compatibili con la funzionalità14. Infine, un modo più diretto per convalidare la fusione del recettore sarebbe quello di utilizzare un test funzionale in vitro con recettore marcato insieme a versioni non marcate14.
L’approccio di quantificazione affronta difficoltà specifiche nella segmentazione accurata della membrana nei neutrofili in vivo. Nelle cellule di natura epiteliale, la quantificazione dei livelli dei recettori può essere eseguita automaticamente normalizzando i livelli del recettore di membrana in un marcatore di controllo, che può essere espresso in tandem o separatamente9. In effetti, abbiamo applicato un tale approccio, quando abbiamo utilizzato il test di riconoscimento del ligando in embrioni gastrulanti14. Tuttavia, i neutrofili subiscono cambiamenti complessi e rapidi nella forma delle cellule in vivo, rendendo difficile la segmentazione della membrana sia in 2D che in 3D14. Questo è ancora più difficile quando i neutrofili si raggruppano, che si verifica in molti contesti fisiologici29. La metrica di contrasto supera questa limitazione in quanto non richiede la segmentazione della membrana, ma riflette invece lo stato complessivo della distribuzione del recettore nella cellula (membranoso / liscio vs vescicolare / punteggiato). È importante notare che la metrica di contrasto può essere influenzata dal contrasto complessivo dell’immagine, quindi è necessaria la normalizzazione dei valori delle singole cellule a un riferimento interno per tenere conto della variabilità del segnale in diversi embrioni / campioni. Ad esempio, abbiamo usato il valore medio di contrasto cellulare dei neutrofili non responsivi nel CHT (cioè neutrofili che rimangono fermi e non migrano nella pinna ventrale)14. Un’ulteriore possibilità sarebbe quella di normalizzare con i valori di contrasto di un marcatore di controllo nella stessa cella. Ciò fornirebbe una soluzione quando non è disponibile un riferimento interno di cellule non rispondenti e potrebbe probabilmente risolvere differenze quantitative più sottili nella dinamica dei recettori tra condizioni diverse.
La posizione dell’imaging è un’altra variabile da considerare. La ragione per scegliere la ferita della pinna ventrale qui, al contrario del più comunemente usato modello di ferita della pinna caudalemodello 16,30, è perché il sito di ferimento si trova vicino al sito di residenza dei neutrofili / origine migratoria. Ciò accelera la tempistica del test, poiché ci vuole relativamente poco tempo per l’arrivo dei neutrofili. Inoltre, offre l’opportunità di catturare il comportamento cellulare sia all’origine della migrazione (CHT) che nella posizione di interesse target (ferita). Questo è rilevante qui, perché la risoluzione spaziale e temporale richiesta per l’imaging subcellulare è difficile da combinare con un ampio campo visivo o una scansione multi-posizione. Pertanto, il test della ferita della pinna ventrale consente di tracciare l’evoluzione della risposta migratoria dall’origine della migrazione e la cattura simultanea di fluttuazioni non specifiche del recettore nelle cellule che non rispondono. Come accennato in precedenza, quest’ultimo è utile ai fini della quantificazione in quanto fornisce un riferimento interno per dinamiche non specifiche. In altri sistemi, potrebbe non essere possibile avere un tale riferimento interno, nel qual caso i valori di contrasto di un marcatore a membrana coespresso fornirebbero un controllo alternativo.
In sintesi, prevediamo che la metodologia è applicabile ad altri sistemi e può essere implementata per una varietà di scopi. Ad esempio, gli stessi reporter potrebbero essere utilizzati in altri contesti infiammatori, come le impostazioni di infezione o altri modelli di malattia. Il repertorio delle linee reporter del recettore zebrafish potrebbe essere esteso ad altri recettori di segnalazione, per comprendere i meccanismi di segnalazione o segnalare le dinamiche del ligando in vivo. L’approccio può essere combinato con tecniche di knockdown/knockout per interrogare le basi meccanicistiche delle dinamiche osservate. Ad esempio, la perturbazione dell’espressione del ligando può indicare la dipendenza dal ligando per le dinamiche dei recettori osservate. In futuro, prevediamo che il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato per incorporare l’inserimento knock-in dei giornalisti. In definitiva, i risultati che utilizzano questa metodologia fornirebbero nuove intuizioni preziose al di là della comunità dei pesci zebra, data la conservazione di questi recettori di segnalazione nei mammiferi e la relativa sfida di condurre questi studi in organismi più grandi.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Christine Holt e Bill Harris per l’aiuto con la microscopia confocale. Ringraziamo Darren Gilmour per i costrutti della spina dorsale del timer fluorescente e Anna Huttenlocher per il vettore backbone Tol2-Lyz. Ringraziamo Steve Renshaw per la linea Tg(mpx:GFP)i114 . Questo lavoro è stato supportato dal MRC (MR/L019523/1), dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e una sovvenzione Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. è stato supportato da un MRC DTP studentship e in parte dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione. H.W. è stato supportato da un MRC DTP Studentship. H.P. è stato supportato da una sovvenzione di dottorato Wellcome Trust (105391 / Z / 14 / Z) e in parte da un Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione e MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |