Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los niños menores de cinco años de edad, sobre todo en entornos de escasos recursos en todo el mundo 1,2. Rangos de enfermedad neumocócica de infecciones localizadas a condiciones que amenazan la vida tales como la neumonía, sepsis y meningitis 1,2.
Más de 90 serotipos de neumococo se han identificado sobre la base de las diferencias en su polisacárido capsular 3. Las vacunas actuales se dirigen al polisacárido capsular y proporcionan protección contra los principales serotipos causantes de enfermedad invasiva 4. Serotipificación neumocócica aislamientos es importante para evaluar el impacto de la vacunación en el carro y la enfermedad, así como proporcionar información epidemiológica más amplia de 5,6. El método actual "estándar de oro" para la serotipificación neumocócica es la prueba Quellung, pero es mucho tiempo y requiere cierta habilidad para perform 7. Aglutinación de látex es un método serotipificación alternativa recomendada por la Organización Mundial de la Salud 7. Aglutinación de látex es rápido y fácil de realizar, y se emplea en muchos laboratorios en todo el mundo 8-11. Es importante destacar que, de aglutinación de látex ha demostrado una precisión comparable a la prueba Quellung para serotipificación neumocócica 10,12-14. En general, este método es ideal para entornos de escasos recursos, así como laboratorios de alto rendimiento.
Reactivos de aglutinación del látex ('reactivos de látex') son creados por la unión de anticuerpos a partículas de látex 15. En una reacción positiva, estas partículas marcadas se aglutinan en presencia de antígeno específico. Reactivos de látex comerciales están disponibles para un rango limitado de serotipos. Reactivos de látex también se pueden preparar en casa utilizando comercialmente disponibles antisueros 10. Las mezclas de antisueros ('piscinas'), así como antisueros específicos para s neumocócicaserogroups (por ejemplo, grupo 19), los serotipos individuales (por ejemplo, el serotipo 5), y a los antígenos específicos ("factores", por ejemplo., factor de reconocimiento de serotipo 19A 19C) para definir aún más serotipos dentro de los grupos están disponibles 16.
Este manuscrito describe los pasos principales en la producción de reactivos de látex utilizando fijación pasiva de antisueros disponibles comercialmente a las partículas de látex. Se describen los controles de calidad (QC) aspectos de este método, y un protocolo para el uso de reactivos de látex para la serotipificación neumocócica está incluido.
Aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación neumocócica. Neumocócicas reactivos de aglutinación de látex comerciales están disponibles, pero en la actualidad no diferencian todo neumocócica conocida serotipos 10,12. Sin embargo, los reactivos de aglutinación de látex pueden ser fácilmente producidos en la empresa utilizando antisueros comprado levantado contra los antígenos capsulares de neumococos específicos. En el método descrito aquí, los anticuerpos se unen a pasivamente partículas de látex para hacer un conjunto de reactivos de aglutinación de látex.
Una reacción positiva de látex se produce cuando los anticuerpos específicos unidos a las partículas de látex se unen a antígenos en la cápsula de polisacáridos del neumococo aislar 18,19. Las partículas de látex unidos a los anticuerpos permiten la reacción específica antígeno-anticuerpo para ser visualizado sin aumento.
Aglutinación de látex es un método adecuado para laboratorios de alto rendimiento de unD también para entornos de escasos recursos. Principales ventajas del método de aglutinación de látex son que no se requiere equipo especializado para realizar la prueba, los reactivos tienen una vida útil de al menos 2 años cuando se almacena a 4 ° C 8, y que es barato, sencillo y rápido de realizar. Serotipificación un aislado neumocócica por aglutinación de látex tarda aproximadamente 10 min, y hasta cuatro reactivos de látex se puede probar en paralelo por una diapositiva. Además, si la prevalencia de los serotipos es conocido por el ajuste epidemiológica pertinente, las pruebas pueden llevarse a cabo en rondas empezando con las piscinas que contienen los serotipos más comunes de manera similar a la prueba de Quellung 17. Este enfoque minimiza el número de ensayos necesarios para determinar el serotipo. El método también es altamente reproducible entre diferentes operadores (datos no presentados). Una desventaja de la serotipificación de aglutinación del látex es que la producción de los reactivos es mucho tiempo, teniendo aproximadamente 4 horas; aunque múltiples ReageNTS puede ser fácilmente producido en paralelo. Además, algunos antígenos son comunes a través de diferentes serotipos de neumococo, resultando en reacciones cruzadas con algunos antisueros (por ejemplo, el serotipo 29, 42 y el Grupo 35). Sin embargo, estas reacciones cruzadas están bien caracterizados utilizando antisueros comerciales (que generalmente se preabsorbió para eliminar los anticuerpos de reacción cruzada más problemáticas) y tablas de reacción adicionales se proporcionan por el fabricante con el fin de distinguir qué serotipo está presente. Reactivos de látex también pueden cruzar reaccionar si los anticuerpos no están alineados correctamente en las partículas de látex; éstos son detectados como fallas de control de calidad. En nuestra experiencia, riguroso control de calidad es fundamental para el éxito de este método, incluso cuando se utilizan antisueros disponibles comercialmente para la producción. QC tarda aproximadamente 15 min por reactivo y se basa en un conjunto de control de calidad apropiado aislados como se describe anteriormente.
El método aquí descrito da lugar a reactivos que dan una reacción positiva así widelgada el periodo de prueba. En nuestra experiencia, los falsos positivos son raros en la práctica (datos no mostrados). Se observan reacciones negativas falsas ocasionales; por lo general se relacionan con problemas conocidos con un antisuero en particular (por ejemplo, el serogrupo 6 aislados no pueden reaccionar con piscina B antisuero), o regulación a la baja de la expresión de la cápsula por el aislado. Usando el algrorithm serotipificación proporcionado por el fabricante es también importante, ya que en la mayoría de los casos una reacción positiva o negativa falsa dará lugar a un resultado "extremo ciego '. En estos casos, y cuando las reacciones son difíciles de interpretar, se recomienda repetir la prueba-y / o ensayo por un método alternativo tal como la reacción de Quellung.
Algunos de solución de problemas en ocasiones se requiere para hacer los reactivos de látex satisfactorios. En el método descrito aquí, el anticuerpo se une a partículas de látex a través de adsorción pasiva 15,19, por lo que una variable crítica es la concentración de anticuerpo utilizado, que determina qué tan bienla superficie de las partículas de látex se cubre y la posterior alineación de los sitios activos de anticuerpos 15,20. En consecuencia, si el exceso de anticuerpo insuficiente o está unido a las partículas de látex, las reacciones antígeno-anticuerpo no será óptima, y los reactivos pueden ser insatisfactorios producido 15,20,21. Como los títulos de anticuerpos varían entre los diferentes lotes de antisueros, un conjunto estándar de diluciones puede no producir los reactivos que se desempeñan bien 8. Un punto de partida útil es el uso de una dilución 1:40 de antisuero, y si esto no tiene éxito, diluir el antisuero más. En nuestra experiencia, esto generalmente se resuelve el problema 8. En un pequeño número de casos reactivos pueden mostrar aglutinación débil que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión cuando se prueba con destino aísla. En estos casos diluir el antisuero no mejora la calidad del reactivo, pero los reactivos satisfactorios por lo general pueden ser producidos por la omisión de la centrifugación y etapas de lavado 8,22 </sup>.
Partículas de látex recubiertas de anticuerpo se utilizan comúnmente en microbiología de diagnóstico para la detección, identificación o el serotipado de muchos microbios diferentes 15,20. Como tal, el método descrito aquí puede ser adecuado para la preparación de reactivos de látex para otros fines, siempre antisueros adecuado está disponible y los procedimientos de control de calidad adecuados son adoptados.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |