乳胶凝集试验是血清型肺炎链球菌简单,快速,廉价的方法,并且也被广泛应用在诊断微生物。这份手稿描述了内部生产的乳胶凝集试剂的质量控制程序和该技术的肺炎球菌血清型的应用程序。
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
肺炎链球菌 (肺炎球菌)是发病率和死亡率在儿童的重要原因五岁以下的旧世界各地,特别是在资源贫乏1,2。从局部感染到危及生命的疾病如肺炎,败血症肺炎球菌疾病的范围和脑膜炎1,2。
超过90种血清型肺炎链球菌已根据其荚膜多糖3的差异识别。当前的疫苗针对荚膜多糖和从引起侵袭性疾病4的主要血清型提供保护。血清型肺炎球菌菌株是评估疫苗的运输和疾病的影响,并提供更广泛的流行病学资料5,6重要。目前的“金标准”方法,肺炎球菌血清型的荚膜肿胀试验,但它是耗时的,需要一些技巧来PERFORM 7。乳胶凝集是推荐世界卫生组织7的替代血清分型方法。乳胶凝集快速和简单的执行,并在全球范围内8-11应用在许多实验室。重要的是,乳胶凝集显示精度相媲美的荚膜肿胀试验对肺炎球菌血清型10,12-14。总体来说,这种方法非常适合于资源贫乏,以及高通量实验室。
胶乳凝集试剂(“胶乳试剂”)由抗体的附着到胶乳颗粒15产生。在积极的反应,这些标记颗粒凝集的特异性抗原的存在。商业乳胶试剂可用于血清型的范围限制。在内部使用市售的抗血清10胶乳试剂,也可制得。抗血清的混合物(“池”)以及特异性抗血清对肺炎球菌šerogroups( 例如,组19),从个人的血清型( 例如血清型5),并以特定的抗原(“因素”, 如 ,因子19C识别血清型19A),用于进一步定义内组的血清型可用16。
该原稿概述了使用被动附着市售的抗血清到胶乳颗粒在生产胶乳试剂的主要步骤。该方法的质量控制(QC)方面进行描述和协议的使用胶乳试剂的肺炎球菌血清型被包括在内。
乳胶凝集是肺炎球菌血清型的简单,快捷,廉价的方法。商业肺炎球菌乳胶凝集试剂可用,但他们目前还无法区分所有已知的肺炎球菌血清型10,12。然而,胶乳凝集试剂可以容易地在内部使用针对特定肺炎球菌荚膜抗原购抗血清制备。在这里所描述的方法中,抗体被被动地附着到胶乳颗粒,使一组的胶乳凝集试剂。
当结合到乳胶粒子的特异性抗体连接到抗原上的肺炎球菌的多糖胶囊隔离18,19所产生的正极胶乳反应。附着于抗体的胶乳颗粒允许在不放大到被可视化的特定抗体 – 抗原反应。
乳胶凝集方法适宜于高通量实验室的D还为资源贫乏。胶乳凝集法的主要优点是,没有专门的设备需要执行的测试,试剂具有至少2年的保质期储存于4℃下8时,并且它是便宜的,简单的和快速的执行。通过胶乳凝集血清型肺炎球菌菌株需要大约10分钟,和最多四个胶乳试剂可以在一个滑动并行进行测试。此外,如果血清型的流行率是已知的相关流行病学设定,测试可以在轮开始用含有最常见的血清型相似于荚膜肿胀试验17的池进行。这种方法可以减少所需要的,以确定血清型的测试次数。该方法也不同运营商之间的高度重现性(数据未示出)。乳胶凝集血清型的缺点是生产的试剂是费时,服用约4小时;虽然多个reage核苷酸可以很容易地在平行来制造。此外,一些抗原在不同的肺炎球菌血清型共同的,从而导致交叉反应与某些抗血清( 例如 ,血清型29,42和35组)。然而,这些交叉反应是公特征在于使用市售的抗血清(通常是预吸附以除去更多的问题交叉反应的抗体)和额外的反应表由生产商以区分哪个血清型存在时提供。胶乳试剂也可交叉反应,如果抗体不上的胶乳颗粒适当地对准;这些被检测为QC故障。根据我们的经验,严格的质量控制是至关重要的这一方法的成功,即使市售的抗血清用于生产。 QC大约需要15分钟每试剂和依赖株上述一组适当的质量控制。
这里介绍的方法将导致试剂给予了积极的反应以及无线网络薄的测试周期。根据我们的经验,误报实际上很罕见的(数据未示出)。偶尔的假阴性反应的观察;通常这些涉及到已知的问题与特定的抗血清( 如血清型6株可能与乙组抗血清反应),或胶囊的表达下调的分离。使用由制造商提供的血清分型algrorithm也是重要的,因为在大多数情况下,假阳性或阴性反应会导致一个“盲端”的结果。在这些情况下,当反应是很难解释,我们建议重复检验和/或测试用的另一种方法,如荚膜肿胀反应。
有些故障是偶尔需要作出令人满意的乳胶试剂。在这里所描述的方法中,该抗体通过被动吸附15,19附着到胶乳颗粒,所以关键的变量是抗体的使用浓度,它决定如何很好胶乳粒子的表面被覆盖和的抗体的活性位点15,20随后对准。因此,如果过量或不足的抗体附着到胶乳颗粒中,抗体-抗原反应,将不会是最佳的,并不能令人满意的试剂可产生15,20,21。作为抗体效价不同批次的抗血清之间变化,一套标准稀释液可能不会产生对执行好的8试剂。一个有用的出发点是用1:40稀释的抗血清,如果这个不成功,进一步稀释血清。根据我们的经验,这通常可以解决问题8。在少数情况下试剂可能会显示弱凝集未伴有暂停结算时进行测试,目标菌株。在这些情况下,稀释的抗血清,并不能改善该试剂的质量,但令人满意的试剂通常可以通过省略离心来制备和洗涤步骤8,22 </sup>。
抗体包被的胶乳颗粒通常用在许多不同的微生物15,20的检测,鉴定或血清分型诊断微生物学。因此,这里所描述的方法可以是适合于制备胶乳试剂用于其他目的,提供适当的抗血清可与适当的质量控制程序被通过。
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |