اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة وتطبيق هذه التقنية لالمصلي المكورات الرئوية.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
العقدية الرئوية (المكورة الرئوية) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في الأطفال دون سن الخامسة من العمر، وخاصة في البيئات الفقيرة بالموارد 1،2 في جميع أنحاء العالم. يتراوح مرض الالتهاب الرئوي من العدوى المحلية إلى الظروف التي تهدد الحياة مثل الالتهاب الرئوي والإنتان والتهاب السحايا 1،2.
أكثر من 90 من الأنماط المصلية المكورات الرئوية تم تحديدها على أساس الاختلافات في السكاريد المحفظة الخاصة 3. اللقاحات الحالية تستهدف السكاريد المحفظة وتوفر الحماية من الأنماط المصلية الرئيسية المسببة للأمراض الغازية 4. التصنيف المصلي المكورات الرئوية المعزولة المهم لتقييم تأثير التطعيم على النقل والمرض وكذلك توفير المعلومات الوبائية أوسع نطاقا 5،6. الطريقة الحالية "المعيار الذهبي" لالمصلي المكورات الرئوية هو اختبار الانتباج، لكنها تستغرق وقتا طويلا ويتطلب بعض المهارة لperfoRM 7. تراص اللاتكس هو طريقة المصلي بديل أوصت بها منظمة الصحة العالمية 7. تراص اللاتكس هو سريعة وبسيطة لأداء، ويعمل في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم 8-11. الأهم من ذلك، وقد أظهرت تراص اللاتكس دقة مماثلة لاختبار الانتباج للالمصلي المكورات الرئوية 10،12-14. عموما، هذه الطريقة مثالية للبيئات الفقيرة الموارد وكذلك مختبرات إنتاجية عالية.
يتم إنشاء الكواشف تراص اللاتكس ('الكواشف اللاتكس') من المرفق من أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس 15. في رد فعل إيجابي، هذه الجزيئات المسمى التصقت في وجود مستضد معين. تتوفر لمجموعة محدودة من الأنماط المصلية الكواشف اللاتكس التجارية. ويمكن أيضا الكواشف اللاتكس تكون مستعدة في المنزل باستخدام أمصال مضادة متاح تجاريا 10. خليط من أمصال مضادة ('حمامات') وكذلك أمصال مضادة محددة لق المكورات الرئويةerogroups (على سبيل المثال، مجموعة 19)، الأنماط المصلية الفردية (مثل المصلي 5)، وإلى مستضدات محددة ("العوامل"، على سبيل المثال، عامل 19C الاعتراف المصلي 19A) متوفرة 16 لمزيد من تحديد الأنماط المصلية ضمن مجموعات.
توضح هذه المخطوطة الخطوات الرئيسية في إنتاج الكواشف اللاتكس باستخدام التعلق السلبي للأمصال مضادة متاح تجاريا لجزيئات اللاتكس. ووصف مراقبة الجودة (QC) جوانب هذه الطريقة، ويتم تضمين بروتوكول لاستخدام الكواشف اللاتكس لالمصلي المكورات الرئوية.
تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة لالمصلي المكورات الرئوية. هي المكورات الرئوية التجارية الكواشف تراص اللاتكس المتاحة، ولكنها حاليا لا تفرق عن المكورات الرئوية المعروفة الأنماط المصلية 10،12. ومع ذلك، لاتكس الكواشف تراص يمكن أن تنتج بسهولة في المنزل باستخدام أمصال مضادة شراؤها التي أثيرت ضد مستضدات معينة محفظية الرئوية. في الطريقة الموصوفة هنا، وترد بشكل سلبي الأجسام المضادة لجزيئات اللاتكس لجعل مجموعة من الكواشف تراص اللاتكس.
يحدث رد فعل إيجابي عندما اللاتكس أجسام مضادة محددة منضمة إلى جزيئات اللاتكس نعلق على مستضدات على كبسولة السكاريد من المكورات الرئوية عزل 18،19. جزيئات اللاتكس تعلق على الأجسام المضادة تسمح ردة فعل معينة الضد مستضد أن تصور بدون تكبير.
تراص اللاتكس هي طريقة مناسبة لمختبرات إنتاجية عالية ود أيضا للبيئات الفقيرة الموارد. المزايا الرئيسية لطريقة تراص اللاتكس هي ما هو مطلوب أي معدات متخصصة لأداء الاختبار، الكواشف لديها الصلاحية لا يقل عن 2 سنوات عند تخزينها في 4 درجات مئوية 8، وأنها غير مكلفة وبسيطة وسريعة لأداء. التصنيف المصلي لعزل المكورات الرئوية من تراص اللاتكس يستغرق حوالي 10 دقيقة، ويمكن اختبار ما يصل إلى أربعة الكواشف اللاتكس بالتوازي على شريحة واحدة. وعلاوة على ذلك، إذا كان من المعروف انتشار الأنماط المصلية لتحديد وبائية ذات الصلة، والاختبار لا يمكن أن يؤديها في جولات بدءا من أحواض تحتوي على الأنماط المصلية الأكثر شيوعا على غرار اختبار الانتباج 17. هذا النهج يقلل من عدد من الاختبارات اللازمة لتحديد النمط المصلي. هذه الطريقة أيضا تكرار للغاية بين المشغلين مختلفة (لا تظهر البيانات). عيوب تراص اللاتكس المصلي هو أن إنتاج الكواشف وقتا طويلا، مع حوالي 4 ساعة. على الرغم من الكواشف متعددةيمكن بسهولة أن تنتج اليلة بشكل متواز. وعلاوة على ذلك، بعض المضادات شائعة عبر الأنماط المصلية الرئوية المختلفة، مما أدى إلى ردود فعل عبر مع بعض أمصال مضادة (على سبيل المثال، النمط المصلي 29، 42 والمجموعة 35). ومع ذلك، تتميز هذه التفاعلات عبر جيدا عند استخدام أمصال مضادة التجاري (والتي عادة ما preabsorbed لإزالة الأجسام المضادة عبر التفاعل أكثر إشكالية) والجداول رد فعل إضافية يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة من أجل التمييز التي المصلي هو الحاضر. تتفاعل الكواشف اللاتكس قد تعبر أيضا إذا لم يتم محاذاة الأجسام المضادة بشكل صحيح على جزيئات اللاتكس. تم الكشف عن هذه الإخفاقات ومراقبة الجودة. في تجربتنا، QC صارمة أمر أساسي لنجاح هذه الطريقة، حتى عند استخدام أمصال مضادة المتاحة تجاريا للإنتاج. QC يستغرق حوالي 15 دقيقة لكل كاشف وتعتمد على مجموعة من العزلات QC المناسبة كما هو موضح أعلاه.
الطريقة الموصوفة هنا النتائج في الكواشف التي تعطي رد فعل إيجابي جيدا وايرقيقة فترة الاختبار. في تجربتنا، وايجابيات كاذبة نادرة في الممارسة (لا تظهر البيانات). ويلاحظ ردود فعل سلبية كاذبة في بعض الأحيان. عادة ما تتصل هذه المشكلات المعروفة مع مصل معين (على سبيل المثال، الزمرة المصلية 6 العزلات قد لا تتفاعل مع تجمع مصل B)، أو تنظيم لأسفل من كبسولة التعبير من قبل عزل. باستخدام algrorithm التصنيف المصلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة المهم أيضا، كما هو الحال في معظم الحالات رد فعل إيجابي أو سلبي كاذبة ستؤدي الى نتيجة "نهاية عمياء". في هذه الحالات، وعندما يصعب تفسير ردود الفعل، ونحن نوصي تكرار الاختبار و / أو اختبار بواسطة طريقة بديلة مثل رد فعل الانتباج.
مطلوب بعض المشاكل أحيانا إلى جعل الكواشف اللاتكس مرضية. في طريقة وصفها هنا، يتم إرفاق أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس عبر الامتزاز السلبي 15،19، لذلك المتغير الحاسم هو تركيز الأجسام المضادة المستخدمة، والذي يحدد مدىيتم تغطية سطح جزيئات اللاتكس والمحاذاة لاحقة من الأجسام المضادة المواقع المفعلة 15،20. بالتالي، إذا تم إرفاق كافية أو الزائد الأجسام المضادة للجزيئات اللاتكس، ردود فعل الضد مستضد لن يكون الأمثل، ويمكن أن تنتج المواد الكيميائية غير مرضية 15،20،21. كما التتر الضد تختلف بين الكثير مختلفة من أمصال مضادة، مجموعة قياسية من التخفيفات قد لا تنتج الكواشف التي تحقق أداء جيدا 8. وهناك نقطة انطلاق مفيدة هو استخدام 01:40 التخفيف من مصل، وإذا لم يكن هذا بنجاح، يخفف من مصل أبعد من ذلك. في تجربتنا هذه عادة حل المشكلة 8. في عدد قليل من الحالات قد تظهر الكواشف ضعيفة تراص الذي لا يرافقه المقاصة لتعليق عند اختباره مع يعزل الهدف. في هذه الحالات تمييع مصل لا تحسين نوعية الكاشف، ولكن يمكن عادة أن تنتج الكواشف مرضية، بحذف الطرد المركزي وغسل الخطوات 8،22 </sup>.
وتستخدم الأجسام المضادة المغلفة الجسيمات اللاتكس عادة في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي للكشف وتحديد أو المصلي العديد من الميكروبات المختلفة 15،20. على هذا النحو، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تكون مناسبة لإعداد الكواشف اللاتكس لأغراض أخرى، شريطة أمصال مضادة مناسبة متاحة ويتم اعتماد إجراءات مراقبة الجودة الكافية.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |