Test d'agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage Streptococcus pneumoniae, et a été largement appliqué en microbiologie de diagnostic. Ce manuscrit décrit la production en interne de réactifs d'agglutination au latex, les procédures de contrôle de la qualité et de l'application de cette technique à sérotypage pneumocoque.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les enfants de moins de cinq ans, en particulier dans les milieux pauvres en ressources de 1,2 à l'échelle mondiale. Plages de la maladie à pneumocoques à des infections localisées à la vie en danger des conditions telles que la pneumonie, la septicémie et la méningite 1,2.
Plus de 90 sérotypes de pneumocoques ont été identifiés sur la base de différences dans leur polysaccharide capsulaire 3. Les vaccins actuels ciblent le polysaccharide capsulaire et offrent une protection contre les principaux sérotypes responsables de la maladie invasive 4. Le sérotypage des isolats de pneumocoques est importante pour évaluer l'impact de la vaccination sur le transport et la maladie ainsi que de fournir des données épidémiologiques plus large de 5,6. La méthode actuelle de «gold standard» pour le sérotypage pneumocoque est le test Quellung, mais cela prend du temps et exige une certaine habileté à perform 7. Agglutination au latex est une méthode de sérotypage solution recommandée par l'Organisation mondiale de la santé 7. Agglutination au latex est rapide et simple à réaliser, et est utilisé dans de nombreux laboratoires dans le monde entier 8-11. Surtout, l'agglutination au latex a montré une précision comparable à l'épreuve Quellung pour le sérotypage pneumocoque 10,12-14. Dans l'ensemble, cette méthode est idéale pour les paramètres de pauvres en ressources ainsi que des laboratoires à haut débit.
Des réactifs d'agglutination au latex («Réactifs» de latex) sont créés par la fixation d'anticorps à des particules de latex 15. Dans une réaction positive, les particules marquées s'agglutinent en présence de l'antigène spécifique. Réactifs au latex commerciaux sont disponibles pour une gamme restreinte de sérotypes. des réactifs de latex peuvent également être préparés en interne à l'aide d'antisérums 10 disponibles dans le commerce. Mélanges d'antisérums («pools») ainsi que des sérums spécifiques à s pneumocoqueerogroups (par exemple, un groupe 19), les sérotypes différents (par exemple, serotype 5), et à des antigènes spécifiques (les "facteurs", par exemple., 19c facteur reconnaissant de sérotype 19A) destiné à définir en outre les sérotypes à l'intérieur de groupes sont disponibles 16.
Ce manuscrit présente les principales étapes de la production de réactifs au latex à l'aide de la fixation passive de disponible dans le commerce sérums anti-particules de latex. Les aspects de contrôle de qualité (QC) de cette méthode sont décrits, et un protocole pour l'utilisation de réactifs de latex pour le sérotypage pneumocoque est inclus.
Agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage pneumocoque. Pneumocoque réactifs d'agglutination au latex commerciaux sont disponibles, mais ils ne font actuellement pas tous les sérotypes pneumococciques connue 10,12. Toutefois, les réactifs d'agglutination au latex peuvent être facilement produits en interne en utilisant des antisérums acheté soulevé contre les antigènes capsulaires pneumococciques spécifiques. Dans le procédé décrit ici, les anticorps sont fixés passivement à des particules de latex pour faire un ensemble de réactifs d'agglutination au latex.
Une réaction de latex positif se produit lorsque les anticorps spécifiques liés à des particules de latex se fixent sur les antigènes de la capsule polysaccharidique pneumococcique de l'isoler 18,19. Les particules de latex attachés aux anticorps permettent la réaction antigène-anticorps spécifique pour être visualisé à l'œil nu.
Agglutination au latex est une méthode appropriée pour les laboratoires à haut débit unD aussi pour les pays à ressources limitées. Les principaux avantages de la méthode d'agglutination au latex sont que aucun équipement spécialisé est nécessaire pour effectuer le test, les réactifs ont une durée de vie d'au moins 2 ans s'il est entreposé à 4 ° C 8, et qu'il est peu coûteux, simple et rapide à effectuer. Le sérotypage un isolat pneumococcique par agglutination au latex prend environ 10 min, et jusqu'à quatre réactifs de latex peuvent être testés en parallèle sur l'une diapositive. En outre, si la prévalence des sérotypes est connu pour le réglage épidémiologique, les tests peuvent être effectués dans les cycles commençant par les piscines contenant les sérotypes les plus courants est similaire à l'essai Quellung 17. Cette approche réduit le nombre de tests nécessaires pour déterminer le sérotype. Le procédé est également très reproductible entre différents opérateurs (données non présentées). Un inconvénient de l'agglutination au latex sérotypage est que la production des réactifs est consommatrice de temps, en prenant environ 4 h; bien reage multiplesnts peut facilement être produit en parallèle. En outre, certains antigènes sont communs entre les différents sérotypes de pneumocoques, entraînant des réactions croisées avec certains antisérums (par exemple, le sérotype 29, 42 et Groupe 35). Cependant, ces réactions croisées sont bien caractérisés en utilisant des antisérums commercial (qui est généralement préabsorbé pour éliminer les anticorps à réaction croisée plus problématiques) et tables de réaction supplémentaires sont fournies par le fabricant afin de distinguer ce qui sérotype est présent. réactifs de latex peuvent également traverser réagissent si les anticorps ne sont pas correctement alignées sur les particules de latex; ceux-ci sont détectés comme des échecs QC. Dans notre expérience, rigoureux QC est essentielle à la réussite de cette méthode, même si antisérums disponibles dans le commerce sont utilisés pour la production. QC prend environ 15 minutes par le réactif et repose sur un ensemble de QC isolats approprié comme décrit ci-dessus.
La méthode décrite ici donne des réactifs qui donnent une réaction bien positif wimince de la période d'essai. Dans notre expérience, les faux positifs sont rares dans la pratique (données non présentées). Réactions négatives faux occasionnels sont respectées; habituellement se rapportent à des problèmes connus avec un sérum particulier (par exemple, le sérogroupe 6 isolats peuvent pas réagir avec piscine B antisérum), ou la régulation négative de l'expression de la capsule par l'isolat. Utilisation de la algrorithm sérotypage fournies par le fabricant est également important, comme dans la plupart des cas une réaction faussement positive ou négative conduira à un résultat «borgne». Dans ces cas, et lorsque les réactions sont difficiles à interpréter, nous vous recommandons de répéter les essais et / ou des essais par une méthode alternative telle que la réaction Quellung.
Certains dépannage est parfois nécessaire de faire réactifs au latex satisfaisants. Dans le procédé décrit ici, l'anticorps est fixé à des particules de latex par adsorption passive 15,19, donc une variable critique est la concentration d'anticorps utilisée, qui détermine la façon dontla surface des particules de latex est recouverte et l'alignement ultérieur des sites actifs d'anticorps 15,20. Par conséquent, si l'anticorps en excès ou insuffisante est attaché aux particules de latex, les réactions anticorps-antigène ne seront pas optimales, et les réactifs non satisfaisantes peuvent être produites 15,20,21. Comme les titres d'anticorps varient entre différents lots d'antisérums, un ensemble standard de dilutions peut pas produire des réactifs qui se comportent bien 8. Un point de départ utile est d'utiliser une dilution 1:40 de sérum, et si ce n'est pas réussie, diluer le sérum plus loin. Dans notre expérience, cela résout généralement le problème 8. Dans un petit nombre de cas réactifs peuvent montrer faible agglutination qui n'est pas accompagné par un effacement de la suspension lorsqu'il est testé avec cible isole. Dans ces cas, la dilution de l'antisérum n'améliore pas la qualité du réactif, mais réactifs satisfaisants peuvent généralement être produites en omettant la centrifugation et des étapes de lavage 8,22 </sup>.
Recouvertes d'anticorps particules de latex sont utilisés couramment en microbiologie de diagnostic pour la détection, l'identification ou le sérotypage de nombreux microbes différents 15,20. En tant que tel, la méthode décrite ici peut être adapté à la préparation des réactifs de latex à d'autres fins, à condition antisérums est disponible et les procédures adéquates sont adoptées QC.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |