ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
肺炎連鎖球菌 (肺炎球菌)は、特に資源の乏しい設定1,2で、世界的に5歳未満の子供における罹患率および死亡率の主要な原因である。肺炎、敗血症など生命を脅かす状況にローカライズされた感染症から肺炎球菌疾患の範囲とは、1,2髄膜炎。
肺炎球菌の90以上の血清型は、それらの莢膜多糖3の差に基づいて同定されている。現在のワクチンは、莢膜多糖を標的とし、侵襲性疾患の原因となる主要な4種の血清型からの保護を提供する。肺炎球菌血清型を分離することは台車や病気に対するワクチン接種の影響を評価するだけでなく、より広範な疫学的情報5,6を提供するために重要である。肺炎球菌血清型の現在の「ゴールドスタンダード」方法は膨化試験であるが、それは時間がかかり、perfoするためにいくつかのスキルが必要ですRM 7。ラテックス凝集は、世界保健機関7が推奨する代替血清型別法である。ラテックス凝集は、実行することが迅速かつ簡単であり、世界中で多くの研究室8-11に採用されている。重要なのは、ラテックス凝集法は、肺炎球菌血清型10,12-14ための膨化試験に匹敵する精度を示している。全体として、このメソッドは、リソースの乏しい設定だけでなく、ハイスループットラボに最適です。
ラテックス凝集試薬(「ラテックス試薬は')ラテックス粒子15に対する抗体の結合によって作成される。陽性反応では、これらの標識された粒子は、特定の抗原の存在下で凝集。市販のラテックス試薬は、血清型の制限された範囲で使用できます。ラテックス試薬はまた、市販の抗血清10を用いて社内で製造することができる。抗血清(「プール」)の混合物だけでなく、肺炎球菌sに特異的な抗血清さらにグループ内での血清型を定義するためのerogroups( 例えば、グループ19)、個別の血 清型( 例えば、血清型5)、および特定の抗原に対する( '要因'、 例えば 、血清型19Aを認識要因19cは)16用意されています。
この原稿は、ラテックス粒子に市販の抗血清の受動的な添付ファイルを用いたラテックス試薬の製造における主要なステップの概要を説明します。品質管理(QC)本方法の態様が記載されており、肺炎球菌血清型のためのラテックス試薬を使用するためのプロトコルが含まれている。
ラテックス凝集は、肺炎球菌血清型のため、簡単な、迅速かつ安価な方法である。市販の肺炎球菌ラテックス凝集試薬が利用可能であるが、それらは現在、すべての既知の肺炎球菌血清型10,12を区別しません。しかし、ラテックス凝集試薬は、容易に特定の肺炎球菌莢膜抗原に対して惹起購入した抗血清を用いて社内で製造することができる。ここに記載の方法において、抗体は、受動ラテックス凝集試薬のセットを作るためにラテックス粒子に結合している。
肺炎球菌の多糖カプセルは18,19を分離する上でラテックス粒子に結合した特異的抗体が抗原に接続すると、正のラテックス反応が起こる。抗体に付着したラテックス粒子は、特定の抗体 – 抗原反応は拡大せずに可視化することを可能にする。
ラテックス凝集法は、ハイスループット実験室のANに適した方法である資源の乏しい設定のためにもdは。ラテックス凝集法の主な利点には特殊な装置がテストを実行するために必要とされないことであり、試薬が4°C 8で保存した場合、少なくとも2年間の貯蔵寿命を有し、それは、安価で簡単かつ迅速であることを実行する。ラテックス凝集法による肺炎球菌分離株の血清型は、約10分を要し、最大4つのラテックス試薬は、1つのスライド上で並行して試験することができる。血清型の有病率は、関連する疫学的状況のために知られている場合にはさらに、テストは膨化試験17と同様に、最も一般的な血清型を含むプールが始まるのラウンドで行うことができる。このアプローチは、血清型を決定するために必要なテストの数を最小限に抑える。この方法はまた、異なるオペレータ間の高度に再現可能である(データは示さず)。ラテックス凝集型別の欠点は、試薬を製造するには、約4時間を考慮して、時間を消費することである。複数レアージュもののNTSは容易に並列的に製造することができる。さらに、いくつかの抗原は、いくつかの抗血清との交差反応で、その結果、異なる肺炎球菌血清型間で共通している( 例えば 、血清型29、42とグループ35)。しかしながら、これらの交差反応(通常はより問題交差反応性抗体を除去するために前吸収される)は、市販の抗血清と追加の反応テーブルを使用する場合によく特徴づけされているが、存在する血清型を区別するために、製造業者によって提供される。抗体は、ラテックス粒子上に適切に位置合わせされていない場合、ラテックス試薬はまた、クロス反応し得る;これらは、QCの障害として検出される。われわれの経験では、厳格なQCは、市販の抗血清を製造するために使用される場合にも、この方法の成功の中心である。 QCは、試薬ごとに約15分かかりますし、適切な品質管理のセット上記のように隔離するに依存しています。
ここで説明する方法は、陽性反応ウェルw iを与える試薬になる試験期間薄い。われわれの経験では、偽陽性(データは示されていない)、実際にはまれである。時折偽陰性反応が観察される。通常、これらは、特定の抗血清の既知の問題( 例えば、血清群6分離株はプールB抗血清と反応しない場合があります)、または分離株によるカプセル発現のダウンレギュレーションに関連している。偽陽性または陰性反応が「盲端」結果につながる多くの場合のように、製造業者によって提供される血清型algrorithmを使用することも重要である。反応は解釈が困難であるときに、これらのケースでは、そして、私たちはそのような膨張反応などの代替の方法で繰り返しテストおよび/またはテストすることをお勧めします。
いくつかのトラブルシューティングが時折満足なラテックス試薬を行う必要がある。ここで説明する方法では、抗体は、受動的吸着15,19を介してラテックス粒子に結合しているので、重要な変数はどれだけかを判断使用される抗体の濃度は、ラテックス粒子の表面を覆い、抗体の活性部位15,20のその後の位置合わせされている。不十分なまたは過剰な抗体をラテックス粒子に結合している場合にはその結果、抗体-抗原反応は最適ではなくなり、不満足な試薬は15,20,21を製造することができる。抗体価は、抗血清の異なるロット間で変化したように、希釈液の標準セットは、ウェル8を実行する試薬を生成しない場合があります。有用な出発点は、1:40希釈の抗血清を使用し、これが成功しない場合、さらなる抗血清を希釈することである。私たちの経験では、これは通常は問題を解決します8。症例数が少ないでは試薬は、標的分離株を用いて検査したときにサスペンションのクリアを伴わない弱い凝集を示してもよい。抗血清を希釈し、これらの場合に、試薬の質を改善しないが、良好な試薬は通常、遠心分離を省略することによって製造することができ、洗浄が8,22ステップ </sup>。
抗体被覆ラテックス粒子は、多くの異なる微生物15,20の検出、同定または血清型のための診断微生物学で一般的に使用される。このように、ここで説明する方法は、適切な抗血清を入手し、適切なQC手順が採用されて提供され、他の目的のためのラテックス試薬を調製するために適切であり得る。
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |