Latex agglutinatie test is een eenvoudige, snelle en goedkope werkwijze voor serotypering Streptococcus pneumoniae en ook grote schaal toegepast in diagnostische microbiologie. Dit manuscript beschrijft de in-house productie van latex agglutinatie reagentia, procedures voor kwaliteitscontrole en de toepassing van deze techniek om pneumokokken serotypering.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (de pneumokok) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij kinderen onder de leeftijd van vijf jaar de hele wereld, vooral in arme omgevingen 1,2. Pneumokokkeninfecties varieert van lokale infecties tot levensbedreigende aandoeningen zoals pneumonie, sepsis en meningitis 1,2.
Meer dan 90 serotypen van pneumokokken geïdentificeerd op basis van verschillen in hun capsulair polysaccharide 3. Voor vaccins gericht de capsulaire polysaccharide en bescherming van de grote serotypen die invasieve ziekten veroorzaken 4. Serotypering pneumokokken isolaten is van belang voor de beoordeling van de impact van vaccinatie op de wagen en de ziekte alsmede het verstrekken van ruimere epidemiologische informatie 5,6. De huidige 'gouden standaard' methode voor pneumokokken serotypering is de Queliung test, maar het is tijdrovend en vereist enige vaardigheid om perform 7. Latex agglutinatie is een alternatieve methode voor serotypering aanbevolen door de World Health Organization 7. Latexagglutinatie is snel en eenvoudig uit te voeren, en wordt gebruikt in veel laboratoria wereldwijd 8-11. Belangrijk is latexagglutinatie aangetoond vergelijkbare nauwkeurigheid aan de Queliung test voor pneumokokken serotypering 10,12-14. Over het algemeen is deze methode ideaal voor arme omgevingen, alsmede high throughput laboratoria.
Latex agglutinatie reagens (reagentia latex ") worden door de binding van antilichamen aan latexdeeltjes 15. In een positieve reactie, deze gemerkte deeltjes agglutineren bij aanwezigheid van antigeen. Commerciële latex reagentia zijn beschikbaar voor een beperkte reeks van serotypen. Latex reagentia kunnen eveneens worden bereid in-house de handel verkrijgbare antisera 10. Mengsels van antisera ("pools") en specifieke antisera pneumokokken serogroups (bijvoorbeeld groep 19), individuele serotypen (bijvoorbeeld serotype 5), en specifieke antigenen ("factoren", bijvoorbeeld. factor 19c herkennen serotype 19A) verder definiëren serotypen in groepen beschikbaar 16.
Dit manuscript beschrijft de belangrijkste stappen in de productie van latex reagentia met passieve bevestiging van commercieel verkrijgbare antisera tegen latexdeeltjes. De kwaliteitscontrole (QC) aspecten van deze werkwijze zijn beschreven, en een protocol voor het gebruik van latex reagentia voor pneumococcen serotypering inbegrepen.
Latex agglutinatie is een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor pneumokokken serotypering. Commerciële pneumokokken latexagglutinatie reagentia beschikbaar zijn, maar ze momenteel geen onderscheid alle bekende pneumokokkenserotypes 10,12. Echter, latex agglutinatie reagentia gemakkelijk worden geproduceerd in eigen huis met behulp van gekochte antisera opgewekt tegen specifieke pneumokokken capsulaire antigenen. In de hier beschreven werkwijze worden antilichamen passief aan latexdeeltjes een reeks latexagglutinatie reagentia maken.
Een positieve latex reactie optreedt bij specifieke antilichamen gebonden aan de latexdeeltjes hechten aan antigenen op de polysaccharide capsule van de pneumococcen isoleren 18,19. De latexdeeltjes aan de antilichamen maken de specifieke antilichaam-antigen reactie gevisualiseerd zonder vergroting.
Latex agglutinatie is een geschikte methode voor high throughput laboratoria eend ook voor arme omgevingen. Belangrijke voordelen van de latex agglutinatie methode zijn dat geen speciale apparatuur nodig om de proef reagentia hebben een houdbaarheid van ten minste 2 jaar bij opslag bij 4 ° C 8, en dat het is goedkoop, eenvoudig en snel uit te voeren. Serotypering een pneumococcen isolaat van latexagglutinatie duurt ongeveer 10 minuten, en vier latex reagentia kunnen worden getest parallel aan een dia. Bovendien, indien de prevalentie van serotypen is gekend voor de epidemiologische instelling tests kunnen worden uitgevoerd in rondes beginnend met de baden met de meest voorkomende serotypen lijken op de Queliung proef 17. Deze benadering minimaliseert het aantal tests nodig serotype bepalen. De werkwijze is ook zeer reproduceerbaar tussen verschillende exploitanten (gegevens niet getoond). Een nadeel van latex agglutinatie serotypering is dat het produceren van de reagentia is tijdrovend, duurt ongeveer 4 uur; hoewel meerdere reants kunnen gemakkelijk worden geproduceerd in parallel. Bovendien zijn sommige antigenen gemeenschappelijk voor verschillende pneumococcen serotypen, waardoor kruisreacties met sommige antisera (bijvoorbeeld serotype 29, 42 en groep 35). Echter, deze kruisreacties goed gekarakteriseerd bij gebruik commerciële antisera (die meestal vooraf geabsorbeerd aan de problematischer kruisreagerende antilichamen te verwijderen) en hulpplanken tabellen werden door de fabrikant om te onderscheiden welke serotype aanwezig is. Latex reagentia kunnen ook oversteken reageren als de antistoffen niet goed zijn uitgelijnd op de latex deeltjes; deze worden gedetecteerd als QC mislukkingen. In onze ervaring, strenge QC is voor het succes van deze werkwijze, ook wanneer de handel verkrijgbare antisera worden voor productie. QC duurt ongeveer 15 minuten per reagens en voert een reeks passende QC isolaten zoals hierboven beschreven.
De hier beschreven methode resulteert in reagentia die een positieve reactie geven goed widun de testperiode. In onze ervaring, valse positieven zijn zeldzaam in de praktijk (gegevens niet getoond). Occasionele vals-negatieve reacties gezien worden; meestal deze betrekking hebben op bekende problemen met een bepaalde antiserum (bijvoorbeeld kan serogroep 6 isolaten niet reageren met zwembad B antiserum), of omlaag regulering van capsule expressie door het isolaat. De serotypering algrorithm door de fabrikant is belangrijk, zoals in de meeste gevallen een vals positieve of negatieve reactie zal leiden tot een "blind end 'resultaat. In deze gevallen en wanneer reacties zijn moeilijk te interpreteren, adviseren wij herhaal-testen en / of het testen van een alternatieve methode zoals het Queliung reactie.
Sommige problemen oplossen is soms nodig om bevredigende latex reagentia maken. In de hier beschreven werkwijze wordt het antilichaam aan latexdeeltjes op passieve adsorptie 15,19 bevestigd, zodat een kritische variabele is de antilichaamconcentratie gebruikt, die bepaalt hoe goedhet oppervlak van de latexdeeltjes is overdekt en de daaropvolgende aanpassing van het antilichaam actieve plaatsen 15,20. Indien derhalve onvoldoende of bovenmatige antilichaam aan de latexdeeltjes is bevestigd, het antilichaam-antigeen reacties zullen niet optimaal zijn, en onbevredigende reagentia kunnen worden geproduceerd 15,20,21. Zoals antilichaam titers variëren tussen de verschillende partijen van antisera, kan een standaardset verdunningen produceren reagentia die goed presteren 8. Een goed uitgangspunt is om een 1:40 verdunning van het antiserum te gebruiken, en als dit niet lukt, verdunnen verder het antiserum. In onze ervaring is dit lost meestal het probleem 8. In een klein aantal gevallen kan reagentia zwakke agglutinatie dat niet gepaard gaat met het ruimen van de opschorting wanneer daarop doelwit isoleert tonen. In deze gevallen verdunnen van antiserum niet de kwaliteit van het reagens, maar voldoende reagentia kunnen gewoonlijk worden bereid door het weglaten van de centrifugatie en wasstappen 8,22 </sup>.
Antilichaam beklede latex deeltjes worden vaak gebruikt in diagnostische microbiologie voor herkenning of serotypering van verschillende microben 15,20. Als zodanig kan de hier beschreven werkwijze geschikt voor het bereiden latex reagentia voor andere doeleinden, mits geschikte antisera is vrij en adequate QC procedures worden vastgesteld.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |