Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l'applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei bambini sotto l'età di cinque anni, in particolare in contesti poveri di risorse 1,2 in tutto il mondo. Gamme di malattia pneumococcica da infezioni localizzate a condizioni di pericolo di vita come la polmonite, la sepsi e la meningite 1,2.
Più di 90 sierotipi di pneumococco sono stati identificati sulla base di differenze nella loro polisaccaride capsulare 3. Vaccini attuali di mira il polisaccaride capsulare e forniscono protezione dalle principali sierotipi che causano malattia invasiva 4. Sierotipizzazione pneumococco isolati è importante per valutare l'impatto della vaccinazione sulla carrozza e le malattie, oltre a fornire informazioni più ampie epidemiologiche 5,6. L'attuale metodo di 'gold standard' per la sierotipizzazione pneumococco è la prova Quellung, ma richiede tempo e richiede una certa abilità a perform 7. Agglutinazione al lattice è un metodo alternativo sierotipizzazione raccomandata dall'Organizzazione mondiale della sanità 7. Agglutinazione del lattice è veloce e semplice da eseguire, ed è impiegato in molti laboratori in tutto il mondo 8-11. È importante sottolineare che, di agglutinazione al lattice ha mostrato un'accuratezza paragonabile alla prova Quellung per la sierotipizzazione pneumococco 10,12-14. Nel complesso, questo metodo è ideale per gli ambienti poveri di risorse, nonché i laboratori ad alto rendimento.
Reagenti di agglutinazione al lattice (latex 'reagenti') sono creati mediante l'applicazione di anticorpi a particelle di lattice 15. In una reazione positiva, queste particelle etichettate agglutinano in presenza di antigene specifico. Reagenti al lattice commerciali sono disponibili per una gamma limitata di sierotipi. Reagenti al lattice possono anche essere preparati in casa utilizzando antisieri disponibili in commercio 10. Miscele di antisieri ('pool'), così come antisieri specifici per s pneumococcoerogroups (ad esempio, gruppo 19), i singoli sierotipi (ad esempio, sierotipo 5), e di antigeni specifici («fattori», ad es., fattore 19c riconoscendo sierotipo 19A) per definire ulteriormente i sierotipi all'interno dei gruppi sono disponibili 16.
Questo manoscritto descrive le principali fasi della produzione di reagenti al lattice utilizzano attaccamento passivo commercialmente disponibile antisieri di particelle di lattice. Il controllo di qualità (QC) aspetti di questo metodo sono descritti, e un protocollo per l'utilizzo di reagenti al lattice per la sierotipizzazione pneumococco è incluso.
Agglutinazione del lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per la sierotipizzazione pneumococco. Reagenti di agglutinazione al lattice pneumococco commerciali sono disponibili, ma attualmente non permettono di distinguere tutti pneumococcica noto sierotipi 10,12. Tuttavia, i reagenti di agglutinazione al lattice possono essere facilmente prodotte in-house usando antisieri acquistato sollevata contro specifici antigeni capsulari pneumococco. Nel metodo descritto qui, gli anticorpi sono passivamente collegati a particelle di lattice per fare una serie di reagenti di agglutinazione al lattice.
Una reazione positiva lattice si verifica quando gli anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si attaccano agli antigeni sulla capsula del polisaccaride pneumococcico isolare 18,19. Le particelle di lattice allegate agli anticorpi consentire la reazione specifica antigene-anticorpo per essere visualizzato senza ingrandimento.
Latex agglutinazione è un metodo adatto per i laboratori ad alto rendimento di und anche per i poveri di risorse. I principali vantaggi del metodo di agglutinazione al lattice sono che nessuna attrezzatura specializzata è necessario per eseguire il test, i reagenti hanno una durata di almeno 2 anni se conservato a 4 ° C 8, e che è poco costoso, semplice e veloce da eseguire. Sierotipizzazione un isolato da pneumococco agglutinazione al lattice impiega circa 10 minuti, e fino a quattro reagenti al lattice può essere testato in parallelo su una diapositiva. Inoltre, se la prevalenza dei sierotipi è noto per l'impostazione epidemiologico rilevante, il test può essere eseguito in turni che iniziano con le piscine che contengono i sierotipi più comuni in modo simile alla prova Quellung 17. Questo approccio riduce al minimo il numero di prove necessarie per determinare il sierotipo. Il metodo è anche altamente riproducibile tra diversi operatori (dati non mostrati). Uno svantaggio di agglutinazione al lattice sierotipizzazione è che la produzione di reagenti molto tempo, prendendo circa 4 ore; anche se Reage multiplanti può essere facilmente prodotta in parallelo. Inoltre, alcuni antigeni sono comuni tra i diversi sierotipi di pneumococco, causando reazioni crociate con alcuni antisieri (ad esempio, sierotipo 29, 42 e Gruppo 35). Tuttavia, queste reazioni trasversali sono ben caratterizzati quando si utilizzano antisieri commerciali (che di solito è preabsorbed per eliminare gli anticorpi cross-reagenti più problematici) e le tabelle di reazione aggiuntivi sono forniti dal produttore, al fine di distinguere quale sierotipo è presente. Reagenti al lattice può anche attraversare reagire se gli anticorpi non sono allineati correttamente sulle particelle di lattice; questi vengono rilevati come errori di QC. Nella nostra esperienza, rigoroso controllo di qualità è fondamentale per il successo di questo metodo, anche quando antisieri disponibili in commercio vengono utilizzati per la produzione. QC richiede circa 15 minuti per ogni reagente e si basa su una serie di appropriate QC isolati come descritto sopra.
Il metodo qui descritto si traduce in reagenti che danno una positiva reazione ben wisottile il periodo di prova. Nella nostra esperienza, i falsi positivi sono rari nella pratica (dati non riportati). Occasionali reazioni false negative si osservano; di solito si riferiscono a problemi noti con un particolare antisiero (ad esempio, sierogruppo 6 isolati non possono reagire con piscina B antisiero), o down regulation dell'espressione capsula da parte l'isolato. Utilizzando il algrorithm sierotipizzazione fornito dal produttore è anche importante, come nella maggior parte dei casi una falsa reazione positiva o negativa porterà a un risultato 'finale cieca'. In questi casi, e quando le reazioni sono di difficile interpretazione, si consiglia di ripetere il test e / o prove con un metodo alternativo, come la reazione Quellung.
Alcuni la risoluzione dei problemi è a volte necessario per rendere reagenti al lattice soddisfacenti. Nel metodo qui descritto, l'anticorpo è attaccato a particelle di lattice tramite adsorbimento passivo 15,19, quindi una variabile critica è la concentrazione di anticorpo utilizzato, che determina quanto benela superficie delle particelle di lattice è coperto e il conseguente allineamento delle anticorpali siti attivi 15,20. Di conseguenza, se l'anticorpo insufficiente o in eccesso è collegato alle particelle di lattice, le reazioni antigene-anticorpo non saranno ottimali, e reagenti insoddisfacenti possono essere prodotti 15,20,21. Come titoli anticorpali variano tra i diversi lotti di antisieri, un set standard di diluizioni non può produrre i reagenti che eseguono bene 8. Un utile punto di partenza è quello di utilizzare una diluizione 1:40 di antisiero, e se questo non è successo, diluire ulteriormente l'antisiero. Nella nostra esperienza questa di solito si risolve il problema 8. In un piccolo numero di casi reagenti possono mostrare agglutinazione debole che non è accompagnato dalla compensazione della sospensione durante il test con l'obiettivo di isolare. In questi casi la diluizione di antisiero non migliora la qualità del reagente, ma reagenti soddisfacenti possono solitamente essere prodotti omettendo la centrifugazione e lavaggio passi 8,22 </sup>.
Legate agli anticorpi particelle di lattice sono utilizzati comunemente in microbiologia diagnostica per la rilevazione, l'identificazione o la sierotipizzazione di molti microbi diversi 15,20. Come tale, il metodo qui descritto può essere adatto per la preparazione di reagenti al lattice per altri scopi, a condizione antisieri adatto è disponibile e di adeguate procedure di controllo di qualità sono adottati.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |