유액 응집 시험은 폐렴 구균 혈청 형을위한 간단하고 신속하고 저렴한 방법, 또한 진단 미생물학 널리 적용되어왔다. 이 원고는 라텍스 응집 시약, 품질 관리 절차의 내재화 및 폐렴 혈청 형이 기술의 애플리케이션을 설명한다.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
폐렴 구균 (폐렴 구균)는 5 세 미만의 아동의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다 오래 전 세계적으로, 특히 자원이 부족한 설정 1,2. 폐렴, 패혈증과 같은 생명을 위협하는 조건에 국소 감염에서 폐렴 구균 질환의 범위 및 1,2 수막염.
폐렴 구균의 90 개 이상의 혈청 형이 확인 된 자신의 피막 다당류 세의 차이에 기초하고있다. 현재 백신은 캡슐 다당류를 대상으로 침습성 질환 사를 일으키는 주요 혈청 형에서 보호 기능을 제공합니다. 폐렴 구균 혈청 형 균주를하는 캐리지와 질병에 대한 백신의 효과를 평가뿐만 아니라, 광범위한 역학 5,6 정보를 제공하는 것이 중요하다. 폐렴 구균 혈청 형에 대한 현재의 '금 표준'방법은 Quellung 시험이지만, 시간 소모적이며 PERFO 일부 기술이 필요RM 7. 라텍스 응집은 세계 보건기구 (WHO) 7 권장하는 다른 혈청 형 방법입니다. 라텍스 응집을 수행 할 수 신속하고 간단하며, 전 세계적으로 8-11 많은 실험실에서 사용된다. 중요한 것은, 라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형 10,12-14에 대한 Quellung 시험에 필적하는 정확도를 보여 주었다. 전반적으로,이 방법은 자원이 부족한 설정뿐만 아니라 높은 처리량 실험실에 이상적입니다.
라텍스 응집 시약 ( '라텍스 시약') 라텍스 입자 (15)에 대한 항체의 부착에 의해 만들어집니다. 양성 반응에서, 이러한 표지 된 입자는 특정 항원의 존재 하에서 응집. 상업 라텍스 시약은 혈청 형의 제한된 범위에 사용할 수 있습니다. 라텍스 시약도 시판 10 항혈청을 사용하여 자체 제조 할 수있다. 항혈청의 혼합물 ( '풀')뿐만 아니라 고유의 폐렴 구균 항혈청erogroups (예를 들어, 그룹 19), 각각의 혈청 형 (예를 들면, 혈청 형 5), 특정 항원 ( '요인', 예를 들면., 혈청 형 19A를 인식 요인 19C) 또한 그룹 내에서 혈청 형을 정의는 16 사용할 수 있습니다.
이 원고는 라텍스 입자에 시판 항혈청의 수동적 인 첨부 파일을 사용하여 라텍스 시약의 생산의 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 품질 관리 (QC) 양태를 설명하며, 폐렴 구균 혈청 형에 대한 라텍스 시약의 사용을위한 프로토콜을 포함한다.
라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형에 대한 간단하고 신속하고 저렴한 방법입니다. 상업 폐렴 구균 라텍스 응집 시약을 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 현재 알려진 모든 폐렴 구균은 10, 12 혈청 형 구분하지 않습니다. 그러나, 라텍스 응집 시약을 쉽게 특정 폐렴 구균 캡슐 항원에 대해 발생 살 항혈청을 사용하여 자체적으로 생성 될 수있다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동적 라텍스 응집 시약의 세트를 만들기 위해 라텍스 입자에 부착된다.
폐렴 구균의 다당류 캡슐 (18, 19)를 분리에 라텍스 입자에 결합 된 특이 항체가 항원에 연결할 때 긍정적 인 라텍스 반응이 발생합니다. 항체에 부착 된 라텍스 입자는 특정 항체 – 항원 반응을 확대없이 가시화 될 수있다.
라텍스 응집은 높은 처리량 실험실에 적합한 방법입니다자원이 부족한 설정에 대한 교리. 라텍스 응집 방법의 주요 장점이 더 전문적인 장비는 테스트를 수행하는 데 필요한되지 않도록하고, 시약은 4 ° C 팔에 저장 될 때 최소 2 년의 수명을 가지고 있고, 그것이 저렴하고 간단하고 빠른 것을 수행 할 수 있습니다. 라텍스 응집에 의해 폐렴 구균 혈청 형을 분리하면 약 10 분 소요되며, 최대 네 개의 라텍스 시약은 하나의 슬라이드에 병렬로 테스트 할 수 있습니다. 혈청 형의 유병률이 중요한 역학 설정 알려져 있다면 또한, 테스트는 테스트 Quellung 17와 마찬가지로 가장 일반적인 혈청 형을 포함하는 풀 라운드에서 시작하여 수행 될 수있다. 이 접근법은 혈청 형을 결정하는 데 필요한 시험 횟수를 최소화한다. 방법은 또한 서로 다른 사업자 간의 재현성이다 (데이터는 미도시). 라텍스 응집 혈청 형의 단점은 시약을 제조하는 것은 약 4 시간을 가지고, 시간 소모적이라는 것이다; 여러 reage하지만NTS 쉽게 병렬로 제조 할 수있다. 또한, 일부 항원 일부 항혈청과 교차 반응의 결과로, 다른 혈청 형에 걸쳐 공통 (예를 들어, 혈청 형 29, 42, 35 그룹). (일반적으로 더 문제가 교차 반응하는 항체를 제거하기 위해 미리 흡수된다) 항혈청과 반응 추가적인 테이블을 사용하는 것은 존재하는 혈청 형을 구별하기 위해 제조자에 의해 제공되는 경우에는, 이러한 교차 반응은 잘 특징 지어진다. 항체는 라텍스 입자에 제대로 정렬되지 않은 경우도 교차 할 수 라텍스 시약은 반응; 이들은 품질 관리 실패로 감지된다. 우리의 경험에 의하면, 엄격한 QC는 시중에서 판매하는 항혈청을 생산에 사용되는 경우에도이 방법의 성공의 핵심입니다. QC 시약 당 약 15 분 소요되며 상기 균주로 적절한 QC의 집합에 의존하고있다.
여기서 설명한 방법은 양성 반응 웰 WI를 제공 시약 초래시험 기간 얇은. 우리의 경험에 의하면, 오탐 (false positive) (데이터는 제시하지 않음) 실제로는 드물다. 가끔 위음성 반응이 관찰된다; 일반적으로 이러한 특정 항혈청 알려진 문제 (예, 혈청군 6 균주는 풀 B 항혈청과 반응하지 않을 수 있음), 또는 분리에 의해 캡슐 식의 다운 조절에 관한 것이다. 거짓 양성 반응 또는 음 '블라인드'말단 결과로 이어질 것이다 대부분의 경우에서와 같이 제조업체에서 제공 algrorithm 혈청 형을 사용하고, 또한 중요하다. 반응은 해석하기 어려운 경우 이러한 경우, 그리고, 우리는 Quellung 반응 같은 대체 방법으로 반복 테스트 및 / 또는 테스트를 권장합니다.
일부 문제는 때때로 만족 라텍스 시약을 만들기 위해 필요합니다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동 흡착 15,19 통해 라텍스 입자에 부착되기 때문에 중요한 변수는 얼마나 잘 이용 결정 항체의 농도이고,라텍스 입자의 표면을 피복하고, 항체의 활성 부위 15,20 후속 정렬된다. 과잉 또는 불충분 한 항체를 라텍스 입자에 부착되는 경우에 결과적으로, 항체 – 항원 반응은 최적이 아닐 것이며, 불만족 15,20,21 시약을 제조 할 수있다. 항체가가 항혈청의 다른 많은 다릅니다으로, 희석 일련의 표준 잘 팔을 수행 시약을 생산하지 않을 수 있습니다. 유용한 출발점 항혈청의 1시 40분 희석을 사용하는 것이며, 이것이 성공적이지 않을 경우, 상기 항혈청을 희석한다. 우리의 경험에서 이것은 보통 문제 8 건을 해결합니다. 소수의 경우에서 시약은 대상이 분리 테스트 할 때 서스펜션의 삭제를 수반하지 않는 약한 응집을 표시 할 수 있습니다. 시약의 품질이 개선되지 않지만, 양호한 시약은 일반적으로 원심 분리를 생략하여 제조 할 수 있으며, 세척 8,22 단계 항혈청 희석 이러한 경우 </sup>.
항체 코팅 된 라텍스 입자는 다양한 미생물 15,20의 탐지, 식별 또는 혈청 형에 대한 진단 미생물학에서 일반적으로 사용된다. 이와 같이, 여기에 기재된 방법은 다른 목적을 위해 라텍스 시약의 제조에 적합 할 수있는, 적절한 항혈청 제공이 가능하고 적절한 QC 절차가 채택된다.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |