Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade, particularmente em locais com poucos recursos de 1,2 em todo o mundo. Gamas de doença pneumocócica de infecções localizadas a condições de risco de vida, tais como pneumonia, sepse e meningite 1,2.
Mais de 90 sorotipos de pneumococos foram identificados com base em diferenças na sua polissacarídeo capsular 3. As vacinas atuais direcionar o polissacarídeo capsular e fornecer proteção contra os principais sorotipos causadores de doença invasiva 4. Sorotipagem pneumocócica isolamentos é importante para avaliar o impacto da vacinação sobre a carruagem e doença, bem como proporcionar informações epidemiológicas mais amplo 5,6. O actual método "padrão ouro" para sorotipagem pneumocócica é o teste Quellung, mas é demorado e requer alguma habilidade para perform 7. Aglutinação em látex é um método de sorotipagem alternativa recomendada pela Organização Mundial da Saúde 7. Aglutinação em látex é rápido e simples de realizar, e é empregada em muitos laboratórios em todo o mundo 8-11. Importante, aglutinação em látex mostrou precisão comparável ao teste Quellung para sorotipagem pneumocócica 10,12-14. No geral, este método é ideal para locais com poucos recursos, bem como laboratórios de alto rendimento.
Os reagentes de aglutinação de látex ('reagentes de látex') são criados por meio da ligação de anticorpos a partículas de látex 15. Numa reacção positiva, estas partículas marcadas aglutinar na presença do antigénio específico. Reagentes de látex comerciais estão disponíveis para uma gama restrita de sorotipos. Reagentes de látex também pode ser preparada em casa usando anti-soros comercialmente disponível 10. Misturas de anti-soro ("pools"), bem como os anti-soros específicos para s pneumocócicaserogroups (por exemplo, grupo 19), os serotipos individuais (por exemplo, o serotipo 5), e a antigénios específicos ("factores", por exemplo., factor de 19c reconhecimento do serotipo 19A) para a definição mais serotipos dentro grupos estão disponíveis 16.
Este manuscrito descreve os principais passos na produção de reagentes de látex utilizando ligação passiva de anti-soros disponíveis comercialmente a partículas de látex. O controlo de qualidade (QC) os aspectos deste método encontram-se descritos, e um protocolo para o uso de reagentes de látex para serotipagem pneumocócica está incluído.
Aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem pneumocócica. Comerciais pneumocócicas reagentes de aglutinação de látex estão disponíveis, mas que atualmente não fazem distinção todos os sorotipos de pneumococos conhecida 10,12. No entanto, reagentes de aglutinação de látex pode ser facilmente produzido em casa usando anti-soros comprado levantada contra antígenos capsulares de pneumococos específicos. No método aqui descrito, os anticorpos são passivamente ligado a partículas de látex para fazer um conjunto de reagentes de aglutinação de látex.
Uma reacção positiva ocorre quando o látex anticorpos específicos ligados às partículas de látex atribuem aos antigénios sobre a cápsula polissacarídica do pneumococo isolar 18,19. As partículas de látex ligados aos anticorpos permite a reacção anticorpo-antigénio específico a ser visualizado sem ampliação.
Aglutinação em látex é um método adequado para um elevado rendimento laboratóriosd também para locais com poucos recursos. As principais vantagens do método são de aglutinação em látex que não é necessário equipamento especializado para executar o teste, os reagentes têm um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando armazenados a 4 ° C, 8, e que é de baixo custo, simples e rápida de realizar. Serotipagem um isolado de pneumococos por aglutinação em látex leva aproximadamente 10 minutos, e até quatro reagentes de látex podem ser testadas em paralelo a uma lâmina. Além disso, se a prevalência de serotipos é conhecida para a configuração epidemiológica relevante, os testes podem ser realizados em rodadas começando com as piscinas que contêm os serotipos mais comuns de modo semelhante ao teste de Quellung 17. Esta abordagem minimiza o número de testes necessários para determinar o serotipo. O método também é altamente reprodutível entre diferentes operadores (dados não mostrados). Uma desvantagem de aglutinação em látex serotipagem é que a produção dos reagentes é demorado, tendo cerca de quatro horas; embora REAGE múltiplaes podem ser facilmente produzidos em paralelo. Além disso, alguns antígenos são comuns a diferentes sorotipos de pneumococo, resultando em reações cruzadas com alguns anti-soros (por exemplo, o sorotipo 29, 42 e Grupo 35). No entanto, estas reacções cruzadas estão bem caracterizados pelo uso comercial anti-soros (o que é normalmente pré-absorvido para remover os anticorpos de reacção cruzada mais problemáticos) e tabelas de reacção adicionais são fornecidos pelo fabricante, a fim de distinguir o que se encontra presente serótipo. Reagentes de látex pode também reagiram de forma cruzada se os anticorpos não estão alinhados adequadamente sobre as partículas de látex; estes são detectados como falhas QC. Na nossa experiência, rigoroso QC é central para o sucesso deste método, mesmo quando os anti-soros disponíveis comercialmente são usados para a produção. QC demora aproximadamente 15 min por reagente e depende de um conjunto de QC apropriada isolados como descrito acima.
O método aqui descrito resulta em reagentes que dão uma reacção positiva bem widiluir o período de teste. Na nossa experiência, os falsos positivos são raros, na prática, (dados não mostrados). Falsos negativos ocasionais são observadas; geralmente estes se relacionam com problemas conhecidos com um anti-soro específico (por exemplo, o sorogrupo 6 isolados não pode reagir com piscina B anti-soro), ou baixa regulação da expressão cápsula pelo isolado. Usando o algrorithm sorotipagem fornecido pelo fabricante também é importante, como na maioria dos casos, uma reação positiva ou negativa falsa levará a um resultado "final cego '. Nestes casos, e quando as reações são de difícil interpretação, recomendamos repetir-testes e / ou testes por um método alternativo, como a reação Quellung.
Alguns solução de problemas é por vezes necessária para fazer reagentes de látex satisfatórios. No método aqui descrito, o anticorpo é ligado a partículas de látex, através de adsorção passiva 15,19, então uma variável crítica é a concentração de anticorpo utilizado, o que determina quão bema superfície das partículas de látex é coberto e o subsequente alinhamento dos locais activos de anticorpos 15,20. Por conseguinte, se o anticorpo em excesso insuficiente ou está ligado às partículas de látex, as reacções antígeno-anticorpo não será óptimo, e reagentes insatisfatórias podem ser produzidos 15,20,21. Como os títulos de anticorpos variar entre diferentes lotes de soros, um conjunto padrão de diluições pode não produzir os reagentes que um bom desempenho 8. Um ponto de partida útil é a utilização de uma diluição 1:40 do anti-soro, se este não é bem sucedida, diluir ainda mais o anti-soro. Em nossa experiência, isso geralmente resolve o problema 8. Em um pequeno número de casos reagentes podem apresentar aglutinação fraca que não é acompanhada de compensação da suspensão, quando testado com alvo isolados. Nestes casos, a diluição de anti-soro não melhora a qualidade do reagente, mas reagentes satisfatórios podem ser geralmente produzidos por omitindo a centrifugação e passos de lavagem 8,22 </sup>.
Revestidas de anticorpo partículas de látex são usados comumente em microbiologia de diagnóstico para a detecção, identificação ou sorotipagem de muitos micróbios diferentes 15,20. Como tal, o método aqui descrito pode ser adequado para a preparação de reagentes de látex para outras finalidades, desde que os anti-soros adequados estão disponíveis e são adequados CQ adoptada.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |