Латекс тестирование агглютинации является простым, быстрым и недорогим методом для серотипирование Пневмококк, и также широко применяется в диагностической микробиологии. Эта рукопись описывает в собственное производство латексной агглютинации реагентов, процедур контроля качества и применение этого метода к пневмококковой серотипирования.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Пневмококк (пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности среди детей в возрасте до пяти лет во всем мире, особенно в условиях ограниченных ресурсов 1,2. Пневмококковые диапазоны болезни от локализованных инфекций, угрожающих жизни заболеваний, таких как пневмония, сепсис и менингит 1,2.
Более 90 серотипов пневмококков были выявлены на основе различий в их капсульного полисахарида 3. Современные вакцины нацелены на капсульный полисахарид и обеспечивают защиту от основных серотипов, вызывающих инвазивное заболевание 4. Серологическое типирование пневмококковых изолятов важно для оценки влияния вакцинации на перевозки и болезней, а также обеспечения более широкого эпидемиологическую информацию 5,6. Способ пневмококковой серотипирования ток «золотым стандартом» является тест Quellung, но это занимает много времени и требует определенных навыков для PERFOгт 7. Латекс агглютинации является альтернативным методом серотипирование рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения 7. Латекс агглютинации быстро и просто выполнять, и используется во многих лабораториях по всему миру 8-11. Важно отметить, что латекс-агглютинации показал сопоставимую точность в тесте Quellung для пневмококковой серотипирования 10,12-14. В целом, этот метод идеально подходит для ограниченными ресурсами, а также с высокой пропускной лабораторий.
Латекс агглютинации реагенты ('латексные реагенты ») создаются привязанности антител к латексных частиц 15. В положительной реакции, эти меченые частицы агглютинации в присутствии специфического антигена. Коммерческие латексные реагенты доступны для ограниченного круга серотипов. Латекс реагенты могут быть также получены в доме с использованием коммерчески доступных сывороток 10. Смеси антисыворотками ('бассейны'), а также антисыворотки к пневмококковой сerogroups (например, группа 19), отдельные серотипы (например, серотипа 5), а также специфические антигены (факторы "', например., коэффициент 19C признать серотип 19а) для дальнейшего определения серотипов в группах имеются 16.
Эта рукопись излагаются основные этапы производства латексных реагентов с использованием пассивного вложения имеющихся в продаже антисыворотки латексных частиц. Контроль качества (QC) аспекты этого метода описаны, и протокол для использования латексных реагентов для пневмококковой серотипирования включен.
Латекс агглютинации является простой, быстрый и недорогой метод для пневмококковой серотипирования. Коммерческие пневмококковых латекс агглютинации реагенты доступны, но они в настоящее время не проводится различия все известные пневмококковой серотипы 10,12. Однако, латекс агглютинации реагенты могут быть легко получены в доме с помощью приобрели антитела на конкретных пневмококковых капсульных антигенов. В способе, описанном здесь, антитела пассивно прикреплен к латексных частиц, чтобы сделать набор реагентов латексной агглютинации.
Положительная реакция латекс происходит, когда специфические антитела, связанные с частицами латекса придают антигенов на полисахарид капсулы из пневмококковых изолировать 18,19. Частицы латекса, прикрепленные к антителам позволяют специфическая реакция антиген-антитело, чтобы быть визуализированы без увеличения.
Латекс агглютинации является подходящим методом для высокой пропускной лабораторий апD также для ограниченными ресурсами. Основные преимущества метода латекс агглютинации в том, что никакое специализированное оборудование не требуется для выполнения теста, реагенты имеют срок годности не менее 2 лет при хранении при 4 ° С 8, и что это недорого, просто и быстро выполнить. Серологическое типирование пневмококковой изолят на латексной агглютинации занимает около 10 мин, и до четырех латексные реагенты могут быть проверены параллельно на одном слайде. Кроме того, если распространенность серотипов известен соответствующий эпидемиологического, тестирование может быть выполнено в раундах, начиная с бассейнов, содержащих наиболее распространенных серотипов аналогично испытанию Quellung 17. Такой подход снижает количество тестов, необходимых для определения серотипа. Способ также высокой воспроизводимостью между различными операторами (данные не показаны). Недостатком латекс агглютинации серотипирования в том, что производство реагентов требует больших затрат времени, с приблизительно 4 ч; хотя многократного reageНТС могут быть легко получены параллельно. Кроме того, некоторые антигены, являются общими для различных серотипов пневмококков, в результате чего перекрестных реакций с некоторой антисыворотки (например, серотипа 29, 42 и группа 35). Тем не менее, эти перекрестные реакции хорошо охарактеризованы при использовании коммерческого антисыворотки (который, как правило, предварительно адсорбированный для удаления более проблематичным перекрестно реагирующих антител) и дополнительные таблицы реакции, при условии, производителем для того, чтобы различать, который присутствует серотипа. Латекс реагенты могут также пересекать реагировать, если антитела не выровнены латексных частиц; они определяются как КК неудач. По нашему опыту, строгий контроль качества является залогом успеха этого метода, даже если имеющиеся в продаже антисыворотки используются для производства. КК занимает примерно 15 мин для каждого реагента и зависит от набора соответствующего QC изолятов, как описано выше.
Метод, описанный здесь приводит реагентов, которые дают положительную реакцию также Wiтонкий тестовый период. По нашему опыту, ложных срабатываний редки в практике (данные не представлены). Наблюдаются Иногда ложные негативные реакции; обычно они касаются известных проблем с конкретной антисыворотки (например, серогруппы 6 изоляты не может реагировать с бассейном B антисыворотки), или вниз регуляции экспрессии капсулы по изолята. Использование серотипирования algrorithm, предоставляемая производителем Также важно, как и в большинстве случаев ложный положительный или отрицательный реакция приведет к "слепой конец 'результате. В этих случаях, и когда реакции трудно интерпретировать, мы рекомендуем повторить тестирование и / или тестирование с помощью альтернативного способа, таких как реакции Quellung.
Некоторые устранение неисправностей иногда требуется сделать удовлетворительные латексные реагенты. В способе, описанном здесь, антитело прикрепляется к латексных частиц с помощью пассивной адсорбции 15,19, таким образом, является критической переменной концентрации антител использовали, который определяет, насколько хорошоповерхность латексных частиц покрыта и последующее выравнивание антител активных участков 15,20. Следовательно, если слишком мало или слишком антитело присоединены к латексных частиц, что реакции антиген-антитело не будет оптимальным, и неудовлетворительные реагенты могут быть получены 15,20,21. Как титры антител варьироваться между различными партиями антисыворотки, стандартный набор разведения не могут производить реагенты, которые хорошо 8. В качестве отправной точки использовать разбавление антисыворотки 1:40, и если это не удается, разбавить антисыворотки дальше. По нашему опыту это обычно решает проблему 8. В небольшом количестве случаев реагенты могут показать слабую агглютинацию, что не сопровождается очистки суспензии, при проверке с целевой изолирует. В этих случаях разбавление антисыворотки не улучшает качество реагента, но, как правило, удовлетворительные реагенты могут быть получены путем исключения центрифугирования и промывки шаги 8,22 </sup>.
, Покрытых антителом, частицы латекса обычно используются в диагностической микробиологии для обнаружения, идентификации или серотипирования различных микробов 15,20. Таким образом, способ, описанный здесь, может быть пригоден для получения латекса реагенты для других целей, при условии, пригодны антисыворотки доступен, и соответствующие процедуры КК принимаются.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |