Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO’lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.
Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97’den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO’lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.
2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü1. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70’inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür 2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşturulan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), yumurtalık kanseri araştırmalarında kullanılan başlıca araçlardır. Kanser hücre hatlarının en büyük avantajı, hızlı genişlemeleridir. Bununla birlikte, sürekli kültürleri, kanser hücresi hatlarının orijinal birincil kanser tümör örneğinden sapmasına neden olan fenotipik ve genotipik değişikliklerle sonuçlanır. Kanser hücre hattı ile primer tümör arasındaki mevcut farklılıklar nedeniyle, hücre hatlarında olumlu etkileri olan ilaç tahlilleri klinik çalışmalarda aynı etkilere sahip olamamaktadır2. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için PDX modelleri kullanılır. Bu modeller, taze yumurtalık kanseri dokusunun immün yetmezlikli farelere implante edilmesiyle oluşturulur. İn vivo modeller oldukları için, insan biyolojik özelliklerine daha doğru bir şekilde benzerler ve sırayla ilaç sonuçlarının daha öngörücüsüdürler. Bununla birlikte, bu modellerin bunları oluşturmak için gereken maliyet, zaman ve kaynaklar dahil olmak üzere önemli sınırlamaları da vardır4.
PDO’lar, hem kanser hücre hatlarının hem de PDX modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelen klinik öncesi araştırmalar için alternatif bir model sunar. PDO’lar hastanın tümörünü ve tümör mikroçevresini özetler ve böylece klinik öncesi araştırmalar için ideal olan in vitro izlenebilir bir model sağlar 2,3,5. Bu 3D modeller, iki boyutlu (2D) hücre hattı muadillerinin sahip olmadığı bir özellik olan birincil tümörü modelleyen kendi kendine organizasyon yeteneklerine sahiptir. Ayrıca, bu modellerin genetik ve işlevsel olarak ebeveyn tümörlerini temsil ettiği gösterilmiştir ve bu nedenle, yeni terapötikleri ve biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Kısacası, hücre hatlarına benzer uzun vadeli genişleme ve depolama yetenekleri sunarlar, ancak aynı zamanda fare modellerine özgü mikro ortamı ve hücre-hücre etkileşimlerini de kapsarlar 4,6.
Mevcut protokol, %97’den daha yüksek başarı oranına sahip hasta kaynaklı tümörler, asitler ve plevral sıvı örneklerinden PDO’ların oluşturulmasını açıklamaktadır. PDO kültürleri daha sonra birden fazla nesil boyunca genişletilebilir ve ilaç tedavisi duyarlılığını ve prediktif biyobelirteçleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, PDO’ların terapötik yanıtlarına dayanarak tedavileri kişiselleştirmek için kullanılabilecek bir tekniği temsil eder.
Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO’ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği ka…
The authors have nothing to disclose.
Ron Bose, MD, PhD’nin rehberliği ve bu protokolün oluşturulmasında Barbara Blachut, MD’nin yardımı için minnettarız. Ayrıca, St. Louis’in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü’ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi’ne, Washington Üniversitesi Dekan’ın Akademik Programı’na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı’na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |