高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養
Summary
患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。
Abstract
オルガノイドは、患者由来の卵巣腫瘍組織、腹水、または胸水から正常に増殖できる3D動的腫瘍モデルであり、卵巣癌の新しい治療法と予測バイオマーカーの発見に役立ちます。 これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、および細胞間および細胞-マトリックス相互作用を再現しています。さらに、それらは形態学的、細胞学的、免疫組織化学的、および遺伝的に原発腫瘍と一致することが示されています。したがって、オルガノイドは腫瘍細胞および腫瘍微小環境に関する研究を容易にし、細胞株よりも優れています。本プロトコルは、97%を超える成功率で患者の腫瘍、腹水、および胸水サンプルから患者由来の卵巣癌オルガノイドを生成するための異なる方法について説明しています。患者サンプルは、機械的消化と酵素消化の両方によって細胞懸濁液に分離されます。次に、基底膜抽出物(BME)を利用して細胞を播種し、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の培養に特異的なサプリメントを含む最適化された増殖培地でサポートします。最初のオルガノイドを形成した後、PDOは、その後の実験のための増殖のための継代を含む、長期間の培養を維持することができる。
Introduction
2021年には、米国で約21,410人の女性が新たに上皮性卵巣がんと診断され、12,940人の女性がこの病気で死亡しました1。手術と化学療法は十分に進歩していますが、進行性疾患の患者の70%以上が化学療法耐性を発症し、診断から5年以内に死亡します2,3。したがって、この致命的な病気を治療するための新しい戦略と、前臨床研究のための代表的な信頼できるモデルが緊急に必要とされています。
原発性卵巣腫瘍から作製されたがん細胞株および患者由来異種移植片(PDX)は、卵巣がん研究で使用される主要な機器です。がん細胞株の主な利点は、その急速な拡大です。しかし、それらの継続的な培養は、表現型および遺伝子型の変化をもたらし、癌細胞株を元の原発癌腫瘍サンプルから逸脱させる。がん細胞株と原発腫瘍の間には既存の違いがあるため、細胞株でプラスの効果がある薬物アッセイは、臨床試験でこれらの同じ効果をもたらすことができません2。これらの制限を克服するために、PDXモデルが使用されます。これらのモデルは、免疫不全マウスに新鮮な卵巣癌組織を移植することによって作成されます。それらは in vivo モデルであるため、ヒトの生物学的特性により正確に似ており、薬物の結果をより予測します。ただし、これらのモデルには、モデルの生成に必要なコスト、時間、リソースなど、大きな制限もあります4。
PDOは、がん細胞株とPDXモデルの両方の限界を克服する前臨床研究の代替モデルを提供します。PDOは、患者の腫瘍および腫瘍微小環境を再現し、したがって、前臨床研究に理想的なin vitro扱い可能なモデルを提供します2,3,5。これらの3Dモデルは、原発腫瘍をモデル化する自己組織化機能を有しており、これはそれらの2次元(2D)細胞株の対応物にはない特徴である。さらに、これらのモデルは、それらの親腫瘍を遺伝的および機能的に表すことが示されており、したがって、新しい治療法および生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルである。要するに、それらは細胞株と同様の長期的な増殖および保存能力を提供するだけでなく、マウスモデルに固有の微小環境および細胞間相互作用も包含する4,6。
本プロトコルは、97%を超える成功率を有する患者由来の腫瘍、腹水、および胸水サンプルからのPDOの作成について説明しています。その後、PDO培養を複数世代にわたって拡張し、薬物療法の感受性と予測バイオマーカーをテストするために使用できます。この方法は、PDOの治療反応に基づいて治療をパーソナライズするために使用できる技術を表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵巣癌は、診断時の進行段階、および化学療法耐性の一般的な発達のために非常に致命的です。卵巣がん研究における多くの進歩は、がん細胞株とPDXモデルを利用することによってなされてきました。ただし、より代表的で手頃な価格の in vitro モデルが明らかに必要です。PDOは、腫瘍の不均一性、腫瘍微小環境、および原発腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームの特徴を正確に表…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルを確立する上で、ロン・ボーズ医学博士の指導とバーバラ・ブラクート医学博士の支援に感謝しています。また、セントルイスの産婦人科および婦人科腫瘍学部門のワシントン大学医学部、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、および生殖科学者開発プログラムに、このプロジェクトを支援してくれたことに感謝します。
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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