Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB’s een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.
Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB’s een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.
In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.
Kankercellijnen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) gemaakt van primaire eierstoktumoren zijn de belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in onderzoek naar eierstokkanker. Een groot voordeel van kankercellijnen is hun snelle expansie. Hun voortdurende cultuur resulteert echter in fenotypische en genotypische veranderingen die ervoor zorgen dat de kankercellijnen afwijken van het oorspronkelijke primaire kankertumormonster. Vanwege de bestaande verschillen tussen de kankercellijn en de primaire tumor, hebben medicijntests met positieve effecten in cellijnen niet dezelfde effecten in klinische onderzoeken2. Om deze beperkingen te overwinnen, worden PDX-modellen gebruikt. Deze modellen worden gemaakt door vers eierstokkankerweefsel te implanteren in immunodeficiënte muizen. Omdat het in vivo modellen zijn, lijken ze nauwkeuriger op menselijke biologische kenmerken en zijn ze op hun beurt meer voorspellend voor de uitkomsten van geneesmiddelen. Deze modellen hebben echter ook aanzienlijke beperkingen, waaronder de kosten, tijd en middelen die nodig zijn om ze te genereren4.
BOB’s bieden een alternatief model voor preklinisch onderzoek dat de beperkingen van zowel kankercellijnen als PDX-modellen overwint. BOB’s recapituleren de tumor en tumormicro-omgeving van een patiënt en bieden zo een in vitro tracteerbaar model dat ideaal is voor preklinisch onderzoek 2,3,5. Deze 3D-modellen hebben zelforganisatiemogelijkheden die de primaire tumor modelleren, wat een kenmerk is dat hun tweedimensionale (2D) cellijn-tegenhangers niet bezitten. Verder is aangetoond dat deze modellen genetisch en functioneel hun oudertumoren vertegenwoordigen en dus betrouwbare modellen zijn voor het bestuderen van nieuwe therapieën en biologische processen. Kortom, ze bieden uitbreidings- en opslagmogelijkheden op lange termijn die vergelijkbaar zijn met cellijnen, maar omvatten ook de micro-omgeving en cel-celinteracties die inherent zijn aan muismodellen 4,6.
Het huidige protocol beschrijft de creatie van BOB’s uit patiënt-afgeleide tumoren, ascites en pleuravloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De BOB-culturen kunnen vervolgens gedurende meerdere generaties worden uitgebreid en worden gebruikt om de gevoeligheid voor medicamenteuze therapie en voorspellende biomarkers te testen. Deze methode vertegenwoordigt een techniek die kan worden gebruikt om behandelingen te personaliseren op basis van de therapeutische reacties van BOB’s.
Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB’s hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren n…
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University’s School of Medicine in St. Louis’s Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University’s Dean’s Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |