Органоиды, полученные от пациента (PDO), представляют собой трехмерную (3D) культуру, которая может имитировать опухолевую среду in vitro. При серозном раке яичников высокой степени злокачественности PDO представляют собой модель для изучения новых биомаркеров и терапевтических средств.
Органоиды представляют собой 3D-динамические модели опухолей, которые могут быть успешно выращены из ткани опухоли яичников, асцита или плевральной жидкости пациента и помогают в открытии новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров рака яичников. Эти модели повторяют клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клетками и матриксом. Кроме того, было показано, что они соответствуют первичной опухоли морфологически, цитологически, иммуногистохимически и генетически. Таким образом, органоиды облегчают исследования опухолевых клеток и микроокружения опухоли и превосходят клеточные линии. Настоящий протокол описывает различные способы получения органоидов рака яичников пациента из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости пациента с вероятностью успеха более 97%. Образцы пациентов разделяются на клеточные суспензии путем механического и ферментативного сбраживания. Затем клетки покрываются с использованием экстракта базальной мембраны (BME) и поддерживаются оптимизированными питательными средами, содержащими добавки, специфичные для культивирования серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). После формирования исходных органоидов PDO могут поддерживать долгосрочную культуру, включая передачу для расширения для последующих экспериментов.
В 2021 году примерно у 21 410 женщин в Соединенных Штатах был впервые диагностирован эпителиальный рак яичников, и 12 940 женщин умерли от этого заболевания1. Несмотря на то, что в хирургии и химиотерапии были достигнуты достаточные успехи, более 70% пациентов с прогрессирующим заболеванием развивают химиотерапевтическую резистентность и умирают в течение 5 лет после постановки диагноза 2,3. Таким образом, срочно необходимы новые стратегии лечения этого смертельного заболевания и репрезентативные, надежные модели для доклинических исследований.
Линии раковых клеток и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), созданные из первичных опухолей яичников, являются основными инструментами, используемыми в исследованиях рака яичников. Основным преимуществом линий раковых клеток является их быстрое распространение. Однако их постоянное культивирование приводит к фенотипическим и генотипическим изменениям, которые заставляют линии раковых клеток отклоняться от исходного образца первичной раковой опухоли. Из-за существующих различий между линией раковых клеток и первичной опухолью анализы лекарств, которые оказывают положительное влияние на клеточные линии, не имеют таких же эффектов в клинических испытаниях2. Для преодоления этих ограничений используются модели PDX. Эти модели создаются путем имплантации свежей ткани рака яичников иммунодефицитным мышам. Поскольку они являются моделями in vivo , они более точно напоминают биологические характеристики человека и, в свою очередь, более предсказывают результаты приема лекарств. Однако эти модели также имеют существенные ограничения, включая стоимость, время и ресурсы, необходимые для их создания4.
PDO предлагают альтернативную модель для доклинических исследований, которая преодолевает ограничения как линий раковых клеток, так и моделей PDX. PDO повторяют опухоль пациента и микроокружение опухоли и, таким образом, обеспечивают управляемую модель in vitro, идеально подходящую для доклинических исследований 2,3,5. Эти 3D-модели обладают возможностями самоорганизации, которые моделируют первичную опухоль, что является особенностью, которой не обладают их двумерные (2D) аналоги клеточной линии. Кроме того, было показано, что эти модели генетически и функционально представляют свои родительские опухоли и, таким образом, являются надежными моделями для изучения новых терапевтических и биологических процессов. Короче говоря, они предлагают возможности долгосрочного расширения и хранения, аналогичные клеточным линиям, но также охватывают микроокружение и межклеточные взаимодействия, присущие мышиным моделям 4,6.
Настоящий протокол описывает создание PDO из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости, полученных от пациентов, с вероятностью успеха более 97%. Затем культуры PDO могут быть расширены для нескольких поколений и использованы для тестирования чувствительности лекарственной терапии и прогностических биомаркеров. Этот метод представляет собой технику, которая может быть использована для персонализации лечения на основе терапевтических реакций PDO.
Рак яичников чрезвычайно смертелен из-за его поздней стадии при постановке диагноза, а также из-за общего развития резистентности к химиотерапии. Многие успехи в исследованиях рака яичников были достигнуты за счет использования линий раковых клеток и моделей PDX; Тем не менее, существуе…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны за руководство Рону Бозе, доктору медицины, доктору философии, и за помощь Барбары Блахут, доктора медицины, в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета в Сент-Луисе, кафедру акушерства и гинекологии и отделение гинекологической онкологии, Программу стипендий декана Вашингтонского университета и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |