Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado
Summary
Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.
Abstract
Los organoides son modelos tumorales dinámicos 3D que se pueden cultivar con éxito a partir de tejido tumoral ovárico derivado del paciente, ascitis o líquido pleural y ayudan en el descubrimiento de nuevas terapias y biomarcadores predictivos para el cáncer de ovario. Estos modelos recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Además, se ha demostrado que coinciden con el tumor primario morfológicamente, citológicamente, inmunohistoquímicamente y genéticamente. Por lo tanto, los organoides facilitan la investigación sobre las células tumorales y el microambiente tumoral y son superiores a las líneas celulares. El presente protocolo describe distintos métodos para generar organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a partir de tumores de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Las muestras de pacientes se separan en suspensiones celulares mediante digestión mecánica y enzimática. Luego, las células se colocan utilizando un extracto de membrana basal (BME) y se apoyan con medios de crecimiento optimizados que contienen suplementos específicos para el cultivo de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC). Después de formar organoides iniciales, los PDO pueden sostener el cultivo a largo plazo, incluido el paso por expansión para experimentos posteriores.
Introduction
En 2021, aproximadamente 21,410 mujeres en los Estados Unidos fueron diagnosticadas recientemente con cáncer epitelial de ovario, y 12,940 mujeres murieron de esta enfermedad1. Aunque se han logrado avances suficientes en cirugía y quimioterapia, más de 70% de los pacientes con enfermedad avanzada desarrollan resistencia quimioterapéutica y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico 2,3. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para tratar esta enfermedad mortal y modelos representativos y confiables para la investigación preclínica.
Las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) creados a partir de tumores ováricos primarios son los principales instrumentos utilizados en la investigación del cáncer de ovario. Una ventaja importante de las líneas celulares de cáncer es su rápida expansión. Sin embargo, su cultivo continuo da como resultado alteraciones fenotípicas y genotípicas que hacen que las líneas celulares cancerosas se desvíen de la muestra original del tumor primario de cáncer. Debido a las diferencias existentes entre la línea celular del cáncer y el tumor primario, los ensayos farmacológicos que tienen efectos positivos en las líneas celulares no tienen los mismos efectos en los ensayos clínicos2. Para superar estas limitaciones, se utilizan modelos PDX. Estos modelos se crean mediante la implantación de tejido fresco de cáncer de ovario en ratones inmunodeficientes. Como son modelos in vivo , se parecen con mayor precisión a las características biológicas humanas y, a su vez, son más predictivos de los resultados de los medicamentos. Sin embargo, estos modelos también tienen limitaciones significativas, incluyendo el costo, el tiempo y los recursos necesarios para generarlos4.
Las PDO ofrecen un modelo alternativo para la investigación preclínica que supera las limitaciones tanto de las líneas celulares cancerosas como de los modelos PDX. Las PDO recapitulan el tumor y el microambiente tumoral de un paciente y, así, proporcionan un modelo intratable in vitro ideal para la investigación preclínica 2,3,5. Estos modelos 3D tienen capacidades de autoorganización que modelan el tumor primario, que es una característica que sus contrapartes de línea celular bidimensional (2D) no poseen. Además, se ha demostrado que estos modelos representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevos procesos terapéuticos y biológicos. En resumen, ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo similares a las líneas celulares, pero también abarcan el microambiente y las interacciones célula-célula inherentes a los modelos de ratón 4,6.
El presente protocolo describe la creación de PDOs a partir de tumores derivados de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Los cultivos PDO pueden expandirse durante múltiples generaciones y usarse para probar la sensibilidad a la terapia farmacológica y los biomarcadores predictivos. Este método representa una técnica que podría utilizarse para personalizar los tratamientos en función de las respuestas terapéuticas de las DOP.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cáncer de ovario es extremadamente mortal debido a su etapa avanzada en el momento del diagnóstico, así como al desarrollo común de resistencia a la quimioterapia. Se han logrado muchos avances en la investigación del cáncer de ovario mediante la utilización de líneas celulares cancerosas y modelos PDX; Sin embargo, existe una necesidad evidente de un modelo in vitro más representativo y asequible. Las PDO han demostrado representar con precisión la heterogeneidad tumoral, el microambiente tumoral y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por la orientación de Ron Bose, MD, PhD, y la ayuda de Barbara Blachut, MD, en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, al Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington y al Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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